[发明专利]Lmx1a介导的与神经干细胞共培养诱导rASCs为DA能神经元的方法

权利要求书

1.Lmx1a介导的与神经干细胞共培养诱导rASCs为DA能神经元的方法，包括以下步骤：

    步骤（1）：构建Lmx1a基因克隆及重组质粒

    以Lmx1a whole transcript cDNA（NM_138396）为模板，引物为：

    P1 up：5′-GCGTCGACGTACCATGCTGGACGGCCTAAAG-3′，

    P1 down：5′-CGGGATCCCGCTTATCAAGATGTGAAGTAAG-3′，

通过PCR扩增获得带SalI和EcoR V酶切位点的DNA片段，将该片段插入pShuttle-CMV中，通过SalI和EcoR V双酶切鉴定，得到重组穿梭质粒pShuttleCMV-Lmx1a，测序并与理论结果一致；

    步骤（2）：构建与包装重组腺病毒Ad-Lmx1a

将步骤（1）重组穿梭质粒pShuttleCMV-Lmx1a先后用PmeI线形化和CIAP进行5′去磷酸化，其产物经纯化后与腺病毒基因组pAdEasy-1同时电转感受态细胞BJ-5183，得同源pAdEasy-1重组质粒，筛选阳性克隆，与pAdEasy-1成功进行同源重组的克隆能被PacI酶切出3.0kb或者4.5kb的片段；

筛选出的pAdEasy-1重组质粒经鉴定后转化XL-10(Gold),扩增、提取质粒，使质粒浓度达到0.1μg/μL，将质粒线性化后转染HEK-293细胞，使重组腺病毒质粒在HEK-293细胞中包装重组腺病毒Ad-Lmx1a，10天后细胞病变脱落呈串珠状，漂浮于上清液中，收集腺病毒颗粒；

    步骤（3）：将感染Ad-Lmx1a的rASCs与NSCs共培养分化为DA能神经元

（a）诱导前，取rASCs第二代细胞，接种于放有玻片且包被过多聚赖氨酸的六孔培养板，培养液为含10%FBS的L-DMEM；培养的NSCs接种于transwell小室中，培养液为含2% B27的Neural Basal培养液;

（b）以最佳MOI的Ad-Lmx1a感染rASCs，并将培养液更换为含2% B27的Neural Basal培养液，使细胞贴壁率维持在85%，三天后再换液为DMEM/F12诱导液I进行预诱导，部分细胞开始聚集；

以上DMEM/F12诱导液I由以下成分组成：

2%FBS，

1.7 μM SHH，

20 ng/mLbFGF，

6 mM β-巯基乙醇，

DMEM/F12培养基;

（c)将接种有NSCs的transwell小室放入接种有（b）的产物细胞的六孔板中，NSCs与（b）的产物细胞在含2% B27的Neural Basal培养液中共培养24h，细胞数目明显增多，3天后将诱导液换液为Neural Basal正式诱导液II，每隔3天换一次诱导液II，直至21天；

以上Neural Basal正式诱导液II由以下成分组成：

2%B27，

1.7 μM SHH,

100 ng/mLFGF-8,

20 ng/mLbFGF, 

1% N2 supplement，

20 μM β-NADP，

Neural Basal培养基。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是步骤（3）中rASCs第二代细胞的培养：

（a）氯胺酮麻醉恒河猴, 无菌条件下取6kg成年恒河猴大网膜脂肪组织1~2g，

PBS中洗涤去除残存的血迹，分离血管和纤维成分, 0.1%I型胶原酶,37℃消化1h；

（b）消化完成后,加入与I型胶原酶等体积的含10%新生小牛犊血清的L-DMEM培养液终止消化，过滤，1500 r/min离心3 min，弃上清，吸取底部沉淀用于rASCs培养；

(c)以1×10⁶接种于T-25培养瓶中，37℃，5%CO₂条件下细胞培养中培养4天，至单层贴壁细胞贴壁率接近90%时，0.25%胰蛋白酶消化，1:2传代，之后随细胞扩增至90%时，按1:2持续体外传代培养。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是步骤（3）中NSCs的培养：

取孕14天的SD大鼠，在无菌条件下取出子宫置于预冷的Hanks缓冲液中，分离出SD胎鼠，在解剖显微镜下取腹侧中脑区，加入0.025%胰酶，37℃消化10 min，用DMEM/F12终止消化，吹匀，1500 r/min离心10 min，用含20 ng/mL bFGF和2%B27的DMEM/F12重悬细胞，接种至T-25 培养瓶，悬浮培养；

每隔48h半量换液一次，每4天1:2传代一次，待细胞团增殖换液为新鲜的含2% B27的Neural Basal培养基。