[发明专利]氨肽酶及其高产菌的高通量筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种氨肽酶及其高产微生物菌株的高通量筛选方法，属于微生物育种、酶工程和发酵工程技术领域。

背景技术

氨肽酶(aminopeptidase)是蛋白水解酶中外肽酶的一类，它们能从蛋白质和多肽链的N末端顺序水解氨基酸，其催化机理可以用下式表示：

在生物体内，氨肽酶不仅维持着细胞的动态平衡，对于细胞的成熟、生长和防御都具有重要的作用，还作为转录调控因子、特异性位点的重组因子和毒素受体参与抗生素的活化与转运。氨肽酶的种类多，不同氨肽酶对N端氨基酸残基的水解能力不同，即使同一类氨肽酶对N端不同氨基酸残基的水解能力也有一定的差异。根据不同氨肽酶对N端氨基酸残基水解的专一性程度不同，可以将氨肽酶分为两大类：一类氨肽酶对N端氨基酸残基专一性低，能水解几乎所有的氨基酸残基，如亮氨酸氨肽酶、赖氨酸氨肽酶、苯丙氨酸氨肽酶，区分这类氨肽酶的依据是它们对不同氨基酸残基的水解速度的快慢，如亮氨酸氨肽酶水解末端亮氨酸残基速度最快，而赖氨酸氨肽酶水解末端赖氨酸残基速度最快。另一类氨肽酶对N端氨基酸残基有严格的专一性，只能特异地水解某一种或几种氨基酸残基，如脯氨酸氨肽酶只能水解末端脯氨酸残基。氨肽酶特有的水解方式和功能，决定了其广泛应用于食品、医药、发酵、饲料及生物技术等行业。

目前氨肽酶制剂主要应用于功能肽的制备和蛋白质水解物的生产加工过程，用以提高营养质量，改善产品的风味。由于氨肽酶能促进不良口感疏水肽的水解、释放其他具有愉快口感的肽和自由氨基酸，氨肽酶已经成为水解蛋白脱苦剂的首选。

随着发酵技术的发展，微生物发酵法已成为氨肽酶工业化生产方法的主流。菌种是工业发酵生产氨肽酶的物质基础，从自然界筛选并在实验室诱变进化一直是发现和创新工业微生物菌种的重要途径。常规的菌种选育方法工作量大、周期长、效率低、成本高。采用高通量方法筛选新型的氨肽酶和氨肽酶高产菌株，既可提高工作效率，降低成本，又能大幅度地提高筛选速度。

发明内容

为了克服筛选新型氨肽酶及其高产菌株的常规方法存在的工作量大、周期长和成本高等问题，本发明提供了一种基于深孔板的微型化培养与基于酶标仪微量化检测的高通量筛选方法。高通量筛选氨肽酶及其高产菌株方法如下：

挑取氨肽酶产生菌的单菌落，适当稀释菌浓度，接种于装有液体种子培养基的深孔板I的孔中，每一孔由板号、行号和列号的组合标记，使每个孔有一个特定的编号。盖上深孔板的三明治盖子，于30～40℃、180～300rpm摇床培养4～10h。将深孔板I深孔中的种子液对应地接种到装有发酵培养基的深孔板II对应的深孔中，盖上三明治盖子，于30～40℃、180～300rpm摇床培养16～48h。将深孔板II放置于孔板离心机，5000～10000×g离心5～30min。深孔板II的深孔中的上清液为粗酶液。以微量化梯度稀释法将粗酶液适当稀释。在酶标板的微孔中加入缓冲液和显色底物溶液或荧光底物溶液，加入稀释的待测粗酶液，以蒸馏水作空白对照，于30～70℃水浴反应10～30min，反应结束立即加入30～50％乙酸溶液终止反应。采用酶标仪测定反应液的吸光度或荧光强度，根据标准曲线和粗酶液的稀释倍数计算酶活。根据酶活测定结果，选择对应的菌株进行摇瓶复筛，获得氨肽酶高产菌株。(见附图1)

氨肽酶产生菌的单菌落可以来自自然界的含菌样品，也可以来自出发菌株的人工诱变的突变株。

采用微量化梯度稀释法稀释菌浓度的具体步骤为：用带滤芯的无菌移液吸头以8通道移液器，自深孔板的A1～H1孔中吸取0.1mL氨肽酶产生菌的悬液，移至装有0.9mL无菌生理盐水的深孔板的A2～H2孔中，振荡混匀，再用8通道移液器吸取0.1mLA2～H2，对应地移至深孔板A3～H3深孔中，如此逐级稀释至适当浓度。

所述液体种子培养基为：麦芽糊精8～15g/L、酵母粉2～10g/L、蛋白胨2～10g/L、磷酸二氢钾0.5～1.5g/L、硫酸镁0.1～0.5g/L，pH7.0、0.1MPa灭菌30min。

所述发酵培养基为：麦芽糊精15～30g/L、酵母粉2～15g/L、蛋白胨2～10g/L、牛肉膏1～20g/L、磷酸二氢钾0.5～3.0g/L、硫酸镁0.05～0.5g/L、氯化钠0.5～1.5g/L，pH6.5～7.5、0.1MPa灭菌30min。