[发明专利]氨肽酶及其高产菌的高通量筛选方法

权利要求书

1.氨肽酶及其高产菌的高通量筛选方法，包括如下步骤：

挑取氨肽酶产生菌的单菌落，接种于装有液体种子培养基的深孔板I的孔中，盖上深孔板的盖子，于30～40℃、180～300rpm摇床培养4～10h；将深孔板I中的种子液对应地接种到装有发酵培养基的深孔板II中，于30～40℃、180～300rpm摇床培养16～48h；将深孔板II放置于孔板离心机，5000～10000×g离心5～30min；深孔板II的深孔中的上清液为粗酶液；以微量化梯度稀释法将粗酶液适当稀释；用酶标板法测定粗酶液的酶活，在酶标板的微孔中加入缓冲液和显色底物溶液或荧光底物溶液，加入稀释的待测粗酶液，以蒸馏水作空白对照，于30～70℃水浴反应10～30min，反应结束立即加入30～50%乙酸溶液终止反应；采用酶标仪测定反应液的吸光度或荧光强度，根据标准曲线和粗酶液的稀释倍数计算酶活；根据酶活测定结果，选择对应的菌株进行摇瓶复筛，获得氨肽酶高产菌株。

2.根据权利要求1所述的氨肽酶高产菌的高通量筛选方法，其特征在于，所述氨肽酶产生菌的单菌落为自然界的含菌样品或突变株。

3.根据权利要求1所述的氨肽酶高产菌的高通量筛选方法，其特征在于，所述液体种子培养基为：麦芽糊精8～15g/L、酵母粉2～10g/L、蛋白胨2～10g/L、磷酸二氢钾0.5～1.5g/L、硫酸镁0.1～0.5g/L、pH7.0、0.1MPa灭菌30min。

4.根据权利要求1所述的氨肽酶高产菌的高通量筛选方法，其特征在于，所述发酵培养基为：麦芽糊精15～30g/L、酵母粉2～15g/L、蛋白胨2～10g/L、牛肉膏1～20g/L、磷酸二氢钾0.5～3.0g/L、硫酸镁0.05～0.5g/L、氯化钠0.5～1.5g/L、pH6.5～7.5、0.1MPa灭菌30min。

5.根据权利要求1所述的氨肽酶高产菌的高通量筛选方法，其特征在于，所述酶反应所用的缓冲液为Tris-HCl缓冲液、磷酸二氢钾缓冲液、磷酸钠缓冲液、HEPES缓冲液和氨-氯化铵缓冲液之中的一种。所述缓冲液的pH为6.5～8.5；缓冲液浓度为0.02～0.2mol/L。

6.根据权利要求1所述的氨肽酶高产菌的高通量筛选方法，其特征在于，所述显色底物是氨基酸对硝基苯胺。

7.根据权利要求1所述的氨肽酶高产菌的高通量筛选方法，其特征在于，所述氨基酸对硝基苯胺为丙氨酸对硝基苯胺、精氨酸对硝基苯胺、天冬酰胺对硝基苯胺、天冬氨酸对硝基苯胺、半胱氨酸对硝基苯胺、谷氨酰胺对硝基苯胺、谷氨酸对硝基苯胺、组氨酸对硝基苯胺、异亮氨酸对硝基苯胺、甘氨酸对硝基苯胺、亮氨酸对硝基苯胺、赖氨酸对硝基苯胺、甲硫氨酸对硝基苯胺、苯丙氨酸对硝基苯胺、脯氨酸对硝基苯胺、丝氨酸对硝基苯胺、苏氨酸对硝基苯胺、色氨酸对硝基苯胺、酪氨酸对硝基苯胺或缬氨酸对硝基苯胺。

8.根据权利要求1所述的氨肽酶高产菌的高通量筛选方法，其特征在于，所述荧光底物是氨基酸-7-氨基-4-甲基香豆素；所述氨基酸-7-氨基-4-甲基香豆素为下列化合物之一：丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、精氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、天冬酰胺-7-氨基-4-甲基香豆素、天冬氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、半胱氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、谷氨酰胺-7-氨基-4-甲基香豆素、谷氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、组氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、异亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、甘氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、赖氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、甲硫氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、苯丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、脯氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、丝氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、苏氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、色氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、酪氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、缬氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素。

9.根据权利要求1所述的氨肽酶高产菌的高通量筛选方法，其特征在于，所述显色底物溶液浓度为2～20μmol/L，荧光底物溶液浓度2～20nmol/L；显色底物用于酶活测定比色的波长为360～450nm；荧光底物用于酶活测定的激发光波长为340～400nm，发射光波长为420～480nm。

10.根据权利要求1所述的氨肽酶高产菌的高通量筛选方法，其特征在于，所述氨肽酶种类的判断方法如下：若底物为亮氨酸对硝基苯胺或亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素时有较高的酶活，而添加其它氨基酸对硝基苯胺或氨基酸-7-氨基-4-甲基香豆素底物时无酶活或者酶活较低，则表明所测样品含有亮氨酸氨肽酶；若添加底物为甲硫氨酸对硝基苯胺或甲硫氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素时有较高的酶活，而添加其它氨基酸对硝基苯胺或氨基酸-7-氨基-4-甲基香豆素底物时无酶活或者酶活较低，则表明所测样品含有甲硫氨酸氨肽酶，其它的氨肽酶如此类推。