[发明专利]一种耐高糖的β-葡萄糖苷酶Bgl4及其表达基因和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程及酶工程技术领域，具体涉及对黑曲霉来源的新型耐高糖β-葡萄糖苷酶Bgl4基因克隆和重组表达及应用。

背景技术

β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC 3.2.1.21）属于外切水解酶类，又称β-D-葡萄糖苷水解酶，是一类在亲核分子间催化转移糖苷的酶，可以在短链的寡糖或纤维二糖内部、在带有芳香基团或烷基的碳水化合物的残基之间打断β-1，4-糖苷键，因而被广泛应用纤维素水解等领域（Science 311:484-489.）。纤维素作为绿色植物光合作用所产生的主要生物有机体之一，与半纤维素和木质素一起作为植物的支撑组织随着农林废弃物不断再生，是地球上最丰富的可再生能源。在纤维素水解过程中，β-葡萄糖苷酶通常不与纤维素直接作用，但是它可以降解对纤维素水解起强烈抑制作用的纤维二糖，同时随着水解液中葡萄糖含量的增加，同样也会对β-葡萄糖苷酶产生强烈的抑制作用。所以发掘具有高葡萄糖耐受能力β-葡萄糖苷酶补充到现有的纤维素水解酶系中是提高酶解效率的有效方法之一。

β-葡萄糖苷酶来源相当广泛，在植物、动物和微生物都能分离纯化出来，而其中曲霉属被认为是最优良菌种，尤以黑曲霉的产量最高。大部分曲霉属菌株能分泌多种组分的β-葡萄糖苷酶，其酶学性质也各不相同，如A.tubingensis通过不同的培养条件至少有4种β-葡萄糖苷酶被纯化和定性。按照β-葡萄糖苷酶对葡萄糖的耐受力分类，β-葡萄糖苷酶可分为耐高糖和不耐高糖两种，分别为：（a）分子量为130-100kDa的属于水解酶家族3的β-葡萄糖苷酶，其分泌较多，活性较高，但其活性受葡萄糖抑制（耐葡萄糖的系数Ki一般不超过30mM）；（b）另一种分子量为40-55kDa的β-葡萄糖苷酶，其分泌较少，活性较低，但能耐受高浓度的葡萄糖，比如来源于A.niger CCRC31494的分子量为49kDa的β-葡萄糖苷酶，其耐葡萄糖的Ki为543mM，来源于A.oryzae的分子量为43kDa的β-葡萄糖苷酶，其耐葡萄糖的Ki为1360mM（Applied Environmemt Microbiology，64:3607-3614.）。虽然有曲霉来源的耐高糖的β-葡萄糖苷酶被纯化，但是相关的基因还没有文献报道。

本发明从黑曲霉菌株（Aspergillus.niger）发酵液中分离得到一种新型的耐高糖的β-葡萄糖苷酶，且具有极其优良的葡萄糖耐受能力（Ki值达到2mol/L），完全可以满足在现有的纤维素降解体系中对β-葡萄糖苷酶葡萄糖耐受能力的要求，经过蛋白纯化和蛋白质测序，得到了其N端序列，经过氨基酸序列比对发现其属于GH72家族，至今未有报道发现该家族存在能够水解β-1，4-糖苷键的β-葡萄糖苷酶。

发明内容

解决的技术问题：本发明主要解决的技术问题在于现在纤维素降解技术中β-葡萄糖苷酶无法耐受高浓度葡萄糖的从而造成生产成本提高的问题，进而提供一种耐高糖的β-葡萄糖苷酶Bgl4及其表达基因和应用。

技术方案：

一种耐高糖的β-葡萄糖苷酶Bgl4，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述耐高糖的β-葡萄糖苷酶Bgl4的表达基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

包含上述核苷酸序列的重组质粒。

包含上述核苷酸序列的重组质粒pPICZαA-Bgl4。

包含SEQ ID NO.2所述基因序列的重组质粒的制备方法，步骤为：

（1）设计引物P1和P2，以黑曲霉菌株Aspergillus niger的mRNA反转录的cDNA为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，得到耐高糖β-葡萄糖苷酶Bgl4基因的PCR扩增产物，所述引物为：

P1：5’-CCGGAATTCATGAAGGGCACCGCTGTCG-3’，下划线表示EcoR I位点；

P2：5’-GCTCTAGATTACAACAGGACGAGTCCGGCA-3’，下划线表示Xba I位点；

（2）将步骤（1）所得PCR扩增产物与pMD-19T克隆载体在16℃下过夜连接；将连接产物转化大肠杆菌Top10F’感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有耐高糖β-葡萄糖苷酶基因的重组质粒pMD-19T-Bgl4；