[发明专利]一种耐高糖的β-葡萄糖苷酶Bgl4及其表达基因和应用

权利要求书

1.一种耐高糖的β-葡萄糖苷酶Bgl4，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述耐高糖的β-葡萄糖苷酶Bgl4的表达基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.包含权利要求2所述核苷酸序列的重组质粒。

4.包含权利要求2所述核苷酸序列的重组质粒pPICZαA-Bgl4。

5.包含SEQ ID NO.2所述基因序列的重组质粒的制备方法，其特征在于：

（1）设计引物P1和P2，以黑曲霉菌株（Aspergillus.niger）的mRNA反转录的cDNA为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，得到耐高糖β-葡萄糖苷酶Bgl4基因的PCR扩增产物，所述引物为：

P1：5’-CCGGAATTCATGAAGGGCACCGCTGTCG-3’，下划线表示EcoR I位点；

P2：5’-GCTCTAGATTACAACAGGACGAGTCCGGCA-3’，下划线表示Xba I位点；

（2）将步骤（1）所得PCR扩增产物与pMD-19T克隆载体在16℃下过夜连接；将连接产物转化大肠杆菌Top10F’感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有耐高糖β-葡萄糖苷酶基因的重组质粒pMD-19T-Bgl4；

（3）通过对Bgl4全序列翻译得到的蛋白序列进行预测并去除信号肽，设计去信号肽引物P3：5’-CCGGAATTCGCGCCTTCGTCGACCATCAAG-3’，下划线表示EcoR I位点，以P3和P2为引物，模板为pMD-19T-Bgl4进行PCR扩增，得到去除信号肽的Bgl4基因片段；

（4）将步骤（3）所得的PCR扩增产物和pPICZαA分别用EcoR I和Xba I双酶切，并分别割胶回收，过夜连接；将连接产物转化大肠杆菌Top10F’感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得耐高糖β-葡萄糖苷酶基因的重组质粒pPICZαA-Bgl4。

6.包含权利要求4所述的重组质粒的毕赤酵母宿主细胞。

7.权利要求1所述耐高糖的β-葡萄糖苷酶Bgl4在纤维素降解中的应用。