[发明专利]一种载蛋白的磁性微球的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物分离材料技术领域，尤其是涉及一种磁性微球蛋白载体的制备方法。

背景技术

纳米超顺磁材料以其优越的性能被广泛应用于磁记录材料、电磁感应器件等工业领域。由于纳米超顺磁性铁氧体材料具有无毒、体内可代谢、磁场下操控性能好等优点，近年来在生物医学领域也得到了广泛应用，如用于生物分离与纯化、肿瘤磁热疗、靶向载药以及磁共振成像等领域。一般来说，适于生物医学领域的纳米超顺磁材料必须具备表面亲水性、水相中分散稳定、生物兼容性好、表面功能化、磁响应速度快等特点。

作为最重要的磁性载体，磁性微球的研究始于20世纪70年代末，Ugelstad成功的采用活性溶胀方法制备了尺度均匀的单分散的磁性聚苯乙烯微球，但是微球尺度为微米尺度，在进行下步应用时必须将微球从生物分子表面再解离下来，因而影响下游操作。另外由于技术本身的限制，微球中磁性物质含量较低，而且疏水的聚苯乙烯的表面使得磁球在生物应用体系中易发生团聚而影响分离效果的稳定性。另一类得到市场广泛应用的是Meltenyi公司的葡聚糖包被的一类尺寸小于50nm磁性颗粒。由于尺寸小，对下游应用与操作没有显著影响，因此在进行生物分离纯化过程中无需从生物分子表面解离磁性颗粒，使用起来十分方便，但是此类材料磁响应程度很低，需要很强的外加磁场才能对其进行捕获，也限制其应用。对于生物体系而言，除了具备高磁含量、单分散以及表面功能特性外，微球应能在各种应用条件下保持良好的分散而不团聚。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一种载蛋白的磁性微球的制备方法。本发明原料简单易得，易于放大，产品性能优越，可调控性强，适用于分离纯化免疫球蛋白及免疫沉淀等领域。

本发明的技术方案如下：

一种载蛋白的磁性微球的制备方法，包括以下步骤：

（1）制备纳米Fe₃O₄颗粒：将可溶性的三价铁离子盐及乙酸钠加入到乙二醇溶液中并搅拌均匀；然后将该混合溶液放入密闭容器中，在180~300℃条件下反应4~72h；冷却后通过磁性分离，将所得产物洗涤后干燥，制得纳米Fe₃O₄颗粒；

（2）Fe₃O₄SiO₂核壳结构的制备：将步骤（1）制得的Fe₃O₄颗粒于盐酸溶液中溶解，然后磁性分离，将分离得到的颗粒洗涤；将洗涤后的颗粒分散于乙醇、蒸馏水、浓氨水的混合溶液中；向混合溶液中逐滴加入原硅酸四乙酯，室温搅拌6~24h后对产物进行磁性分离，并将其洗涤后干燥，得到Fe₃O₄SiO₂核壳结构，即Fe₃O₄SiO₂ 磁性微球；

（3）Fe₃O₄SiO₂ 磁性微球的环氧化：将步骤（2）制得的Fe₃O₄SiO₂磁性微球于盐酸溶液中溶解，然后磁性分离，将分离得到的颗粒洗涤至中性并烘干；将烘干后的颗粒加入到经金属钠干燥脱水的甲苯溶液中，搅拌分散，然后在氮气氛围下加入环氧化试剂和经KOH干燥脱水的三乙胺，加热回流4~6h；冷却至室温，通过磁性分离，将所得产物用甲苯和丙酮洗涤后干燥，得到环氧化的Fe₃O₄SiO₂磁性微球；

（4）载蛋白的磁性微球的制备：将步骤（3）制得的环氧化的Fe₃O₄SiO₂磁性微球用PBS溶液清洗，加入pH为7~9的蛋白溶液，于37℃摇床恒温偶联2~48h后再用PBS溶液清洗；然后加入封闭试剂对未反应的氨基于37℃中和2~12h后用PBS溶液清洗，得到载蛋白的磁性微球。

步骤（3）中，所述环氧化试剂为γ-缩水甘油醚基三甲氧基硅烷。

步骤（4）中，所述封闭试剂为甘氨酸、脱脂奶粉、牛血清白蛋白、乙醇胺、氯化铵。所述蛋白为重组纯化蛋白A、重组纯化蛋白G、抗原、抗体、多肽、酶。

步骤（1）中，乙酸钠的用量为可溶性的三价铁离子盐的2~20倍摩尔量；三价铁离子盐与乙二醇的用量关系为每1mmol的三价铁离子盐加入3~20mL乙二醇。