[发明专利]鉴定小菜蛾钠离子通道基因突变的方法及专用引物

说明书

技术领域

本发明涉及鉴定小菜蛾(Plutella xylostella)钠离子通道基因突变的方法及专用引物，具体涉及鉴定小菜蛾kdr相关para型钠离子通道基因的L1014F突变和T929I突变的方法及其专用引物，本发明提供的方法和专用引物可用于监测小菜蛾对拟除虫菊酯类药剂的抗性。

背景技术

拟除虫菊酯（pyrethroids）是继有机氯、有机磷和氨基甲酸酯之后的具有生物活性强、环境相容性高的一类杀虫剂，由于其具有击倒快、毒力强、杀虫谱广、毒性低和残留少等优点，在农业害虫、林业害虫和卫生害虫的防治上都有广泛使用。随着菊酯类药剂在全世界范围内的连续、大量和广泛使用，许多防治对象都由于巨大的选择压力而对其产生了严重抗性。

Kdr（knockdown resistance）最早在家蝇中发现。1951，Busvine观察到家蝇成虫对DDT和拟除虫菊酯类杀虫剂的快速麻痹和毒杀作用表现出抗性，其后，Milani对其进行了遗传学分析，认为控制此抗性的基因位于家蝇第III染色体上，为隐性的击倒抗性基因（kdr基因），并把此抗性称为“击倒抗性”。1978，Sawicki等又发现对溴氰菊酯产生500多倍抗性的家蝇品系具有超击倒抗性基因（super-kdr基因）。

钠离子通道属电压门控通道，主要调控细胞膜钠离子的瞬时通透性，参与形成细胞膜动作电位的上升相，在神经兴奋性信号传导中具有重要作用，是拟除虫菊酯和许多神经毒性药物作用的分子靶标。

自1996年发现家蝇“击倒抗性”与para型钠通道基因（Vsscl)的突变有关后，至今已在其他13种昆虫的para直向同源钠通道基因序列中发现了20个抗性相关的点突变。Super-kdr基因中的突变位点在家蝇中为M918T/L1014F，在小菜蛾中为T929I/L1014F，在人头虱中为T929I/L932F。

中国占有巨大的菊酯类药剂市场份额，是菊酯类药剂的主要应用地之一，而菊酯类药剂又广泛用于小菜蛾的防治，所以监测小菜蛾对该类药剂的抗性情况对于指导合理用药、延缓抗性发展具有重要意义，特别是在分子水平上对我国田间小菜蛾菊酯类药剂抗性频率进行检测，可为实际应用提供更可靠的依据。由于等位特异PCR分子技术（PASA）快速有效、能处理大批样本、还能区分出SS、RR及杂合子RS，因此被应用到昆虫抗药性位点突变检测上。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定小菜蛾钠离子通道基因突变的方法及专用引物。

本发明提供了一种引物组合物（引物组合物丙），由引物组合物甲和引物组合物乙组成；所述引物组合物甲由序列表的序列1所示的单链DNA分子、序列表的序列2所示的单链DNA分子、序列表的序列3所示的单链DNA分子、序列表的序列4所示的单链DNA分子和序列表的序列5所示的单链DNA分子组成；所述引物组合物乙由序列表的序列6所示的单链DNA分子、序列表的序列7所示的单链DNA分子、序列表的序列8所示的单链DNA分子、序列表的序列9所示的单链DNA分子和序列表的序列10所示的单链DNA分子组成。

所述引物组合物丙可用于如下（a）和（b）：（a）鉴定小菜蛾对于钠离子通道基因自5’末端第12992位核苷酸为CC基因型、TT基因型还是CT基因型；（b）鉴定小菜蛾对于钠离子通道基因自5’末端第14197位核苷酸为CC基因型、TT基因型还是CT基因型。

所述引物组合物丙可用于制备试剂盒；所述试剂盒的用途为如下（a）和（b）：（a）鉴定小菜蛾对于钠离子通道基因自5’末端第12992位核苷酸为CC基因型、TT基因型还是CT基因型；（b）鉴定小菜蛾对于钠离子通道基因自5’末端第14197位核苷酸为CC基因型、TT基因型还是CT基因型。

本发明还保护引物组合物甲，由序列表的序列1所示的单链DNA分子、序列表的序列2所示的单链DNA分子、序列表的序列3所示的单链DNA分子、序列表的序列4所示的单链DNA分子和序列表的序列5所示的单链DNA分子组成。

所述引物组合物甲可用于鉴定小菜蛾对于钠离子通道基因自5’末端第12992位核苷酸为CC基因型、TT基因型还是CT基因型。