[发明专利]快速鉴定小菜蛾鱼尼丁受体基因突变的方法及其专用引物

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速鉴定小菜蛾鱼尼丁受体基因突变的方法及其专用引物。

背景技术

小菜蛾(Plutella xylostella)属于鳞翅目菜蛾科，英文名为“Diamondback moth”，是一种对十字花科植物危害极大的害虫，全国各地均有分布，在我国南方地区常年造成严重危害。目前对小菜蛾的防治仍以化学农药为主，由于杀虫药剂的不合理使用及小菜蛾本身的生物学特性，导致其对几乎所有常用杀虫剂均产生了抗性。

以氯虫苯甲酰胺和氟虫双酰胺为代表品种的双酰胺类杀虫剂对鳞翅目害虫有很好的防治效果。其作用机制独特，通过激活昆虫鱼尼丁受体，导致细胞质钙库中的钙离子大量释放，引起肌肉强烈收缩，从而使害虫立即停止取食，活动能力减弱，肌肉瘫痪最终导致死亡。

氯虫苯甲酰胺自2008年在中国正式登记后，很快被大面积用于防治包括小菜蛾在内的多种鳞翅目害虫。但2010年就已经发现广州田间小菜蛾种群对该药产生了数十倍的抗性，2011年更发现抗性高达2000多倍。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速鉴定小菜蛾鱼尼丁受体基因突变的方法及其专用引物。

本发明提供了一种特异引物组合物，由序列表的序列1所示单链DNA分子、序列表的序列2所示单链DNA分子和序列表的序列3所示单链DNA分子组成。

本发明还保护所述特异引物组合物在制备试剂盒中的应用；所示试剂盒的用途为如下（a）或（b）：（a）鉴定小菜蛾是否发生了鱼尼丁受体基因的G4899E突变；所述鱼尼丁受体基因的G4899E突变指的是鱼尼丁受体基因的开放阅读框自5’末端第14696位核苷酸由G突变为A；（b）辅助鉴定小菜蛾对双酰胺类杀虫剂的抗性。

所述双酰胺类杀虫剂可为氯虫苯甲酰胺和/或氟虫双酰胺。

本发明还保护包括所述特异引物组合物的试剂盒；所示试剂盒的用途为如下（a）或（b）：（a）鉴定小菜蛾是否发生了鱼尼丁受体基因的G4899E突变；所述鱼尼丁受体基因的G4899E突变指的是鱼尼丁受体基因的开放阅读框自5’末端第14696位核苷酸由G突变为A；（b）辅助鉴定小菜蛾对双酰胺类杀虫剂的抗性。所述双酰胺类杀虫剂可为氯虫苯甲酰胺和/或氟虫双酰胺。

本发明还保护所述特异引物组合物的应用，为如下（a）或（b）：（a）鉴定小菜蛾是否发生了鱼尼丁受体基因的G4899E突变；所述鱼尼丁受体基因的G4899E突变指的是鱼尼丁受体基因的开放阅读框自5’末端第14696位核苷酸由G突变为A；（b）辅助鉴定小菜蛾对双酰胺类杀虫剂的抗性。所述双酰胺类杀虫剂可为氯虫苯甲酰胺和/或氟虫双酰胺。

本发明还保护一种鉴定小菜蛾针对G4899E突变的基因型的方法，包括以下步骤：以待测小菜蛾的基因组DNA为模板，分别采用敏感引物对和抗性引物对进行PCR扩增；如果采用所述敏感引物对时扩增得到了70±5bp（如70bp）的扩增产物同时采用所述抗性引物对时没有扩增得到70±5bp（如70bp）的扩增产物，待测小菜蛾为GG基因型；如果采用所述抗性引物对时扩增得到了70±5bp（如70bp）的扩增产物同时采用所述敏感引物对时没有扩增得到70±5bp（如70bp）的扩增产物，待测小菜蛾为AA基因型；如果采用所述敏感引物对时扩增得到了70±5bp（如70bp）的扩增产物且采用所述抗性引物对时扩增得到70±5bp（如70bp）的扩增产物，待测小菜蛾为GA基因型；所述敏感引物对由序列表的序列1所示单链DNA分子和序列表的序列3所示单链DNA分子组成；所述抗性引物对由序列表的序列2所示单链DNA分子和序列表的序列3所示单链DNA分子组成；所述G4899E突变指的是鱼尼丁受体基因的开放阅读框自5’末端第14696位核苷酸由G突变为A。GG基因型的小菜蛾疑似对双酰胺类杀虫剂敏感。AA基因型的小菜蛾疑似对双酰胺类杀虫剂具有抗性。GA基因型的小菜蛾疑似对双酰胺类杀虫剂敏感。AA基因型的小菜蛾对于双酰胺类杀虫剂的抗性高于GG基因型的小菜蛾和GA基因型的小菜蛾。