[发明专利]一种原子转移自由基聚合修饰的金属丝固定化酶反应器的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化学领域，涉及一种原子转移自由基聚合修饰的金属丝固定化酶反应器的制备方法。

背景技术

蛋白质组学研究中最主要的两种研究策略是“top-down”策略和“bottom-up”策略。由于“top-down”策略只能应用于单一的蛋白或简单的蛋白混合物，所以现在最常用的策略依然是“bottom-up”研究策略。鉴于“bottom-up”的两种主要的工作流程（肽质量指纹谱和肽序列标签）中都需要将蛋白质酶解后对其酶解产物进行质谱（MS）分析，并已经成为蛋白质的鉴定及其翻译后修饰的研究最常用的方法。因此，蛋白质的酶解在蛋白质组学的研究中发挥关键作用。但由于传统溶液酶解方式往往存在的酶解时间较长、酶自切物干扰以及蛋白酶不能重复使用等缺陷，为了解决溶液酶解过程中存在的问题，在蛋白质组研究中引进并发展了固定化酶技术。目前已经有了很多关于固定化酶反应器的报道，其材料也是多种多样，包括纳米金颗粒，包裹二氧化硅的磁性纳米颗粒，氧化石墨烯，芯片材料，棉纱，介孔材料，以及石英毛细管整体柱、杂化整体柱固定化酶反应器等，但操作仍然不够方便。

原子转移自由基聚合法（ATRP）是Matyjaszewki K.教授小组于1995年首次提出的一种可控自由基聚合方法，但由于传统的ATRP反应中的催化O₂剂对H₂O及较为敏感，不利于反应的控制，Matyjaszewki K.教授小组进一步发展了电子转移生成催化剂原子转移自由基聚合（AGET ATRP)的方法有效的克服了该问题。电子转移生成催化剂原子转移自由基聚合与传统活性聚合技术相比具有单体覆盖面广、聚合条件温和、易于实现工业化等显著优点。

发明内容

本发明的目的是提供一种原子转移自由基聚合修饰的金属丝固定化酶反应器的制备方法。

本发明所提供的原子转移自由基聚合修饰的金属丝固定化酶反应器的制备方法，具体可包括如下步骤：

（1）制备一端为巯基，另一端为原子转移自由基聚合引发基团的引发剂；

（2）利用巯基与金属丝结合的特性，将所述引发剂固定在所述金属丝表面；

（3）在所述引发剂的作用下，利用甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）单体的原子转移自由基聚合反应，使所述金属丝表面固定上环氧基团；

（4）利用乙二胺使所述环氧基团发生开环反应并暴露氨基；

（5）利用所述氨基与戊二醛反应，使所述金属丝表面修饰上醛基；

（6）利用所述醛基与蛋白酶的氨基反应，进而将蛋白酶固定到所述金属丝表面；

（7）利用含有氨基的化合物对步骤（6）中剩余的醛基进行封闭，从而获得所述金属丝固定化酶反应器。

在上述方法中，所述金属丝从处理方式上讲，为表面去除了氧化膜的金属丝；所述金属丝具体可通过如下方法去除氧化膜：使用酸，如体积分数为25%的硝酸去除所述金属丝表面的氧化膜（浸泡3-10min），后使用易挥发溶剂，如乙醇清洗后干燥，得到待用金属丝。

从材质上讲，所述金属丝为能与巯基发生络合反应的金属丝，可如银、金、铜。在本发明的一个实施例中，所述金属丝具体为银。

所述金属丝长可为5-20cm（如8cm），直径可为0.2-0.5cm，呈弹簧状存在。

在本发明的一个实施例中，所述金属丝长具体为8cm，直径具体为0.3cm（所使用的载体为1.5ml的EP管）。

在本发明的一个实施例中，步骤（1）中所述引发剂具体由11-巯基-1-十一烷醇与2-溴异丁酰溴反应产生。

所述反应中，所述11-巯基-1-十一烷醇与所述2-溴异丁酰溴的配比为0.3g：164μL。

所述反应的催化剂为吡啶；所述反应的液体环境为四氢呋喃；所述反应在无氧（如通氮气除氧）条件下进行。

所述反应结束后，将反应后溶液过滤（滤纸过滤）后，以氮气吹干至略微粘稠，得到所述引发剂，充氮气后密闭4°C保存。

在上述方法中，步骤（3）中，所述甲基丙烯酸缩水甘油酯单体的原子转移自由基聚合反应，催化剂可为过渡金属卤化物（如氯化亚铜），配体可为1，1，4，7，7-五甲基二亚乙基三胺。