[发明专利]一种检测茶树ICE1基因表达特性的新型荧光定量PCR法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测茶树ICE1基因表达特性的新型荧光定量PCR法，特别涉及不同温度(4℃、-5℃)、不同激素(ABA、BR)和干旱处理下检测一定时间段内的茶树ICE1基因表达量的高效快捷新型荧光定量PCR方法。

技术背景

茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)具有喜温畏寒的特性。当前气候的一个显著特点是四季的节律失调，气候的不规则性增强。其中突发的低温致使我国各地越冬期茶园经常遭遇霜冻、冰冻、雪冻或“倒春寒”等危害，造成茶树新梢受害，严重时甚至会导致整株死亡，严重影响产量和品质。

茶树的抗寒性是茶树长期适应低温胁迫过程中逐步发展形成的一种对寒害的抵抗能力。最可靠的抗寒性鉴定方法是通过较长时间的田间栽培。但此种方法所需要的周期比较长且推广繁育难。茶树抗寒性的差异从根本上来讲是自身遗传物质差异造成的如何对造成抗寒性差异的关键基因进行研究；从分子水平评价茶树抗寒性，将会是一条有效、快速便捷的途径。

近年来，随着植物分子生物学和组织培养等相关技术的飞速发展，应用植物基因工程技术改良植物性状，选育抗性新品种的研究引起了广大育种工作者的普遍重视，也给选育茶树抗寒新品种带来了新的曙光。然而，植物抗寒性是一个复杂的数量性状，受到多个基因的调控，这些基因之间互相作用，形成了复杂的冷响应基因表达调控途径。因此，单独将一个冷响应基因导入植物中，往往不能获得预期的抗寒性提高的转基因植株。在植物中有一种编码转录因子(Transcription factor，TF)的基因，它们所编码的TF能特异性的结合在目标基因启动子的顺式作用元件上，控制一系列下游靶基因的表达，从而大大提高植物的抗寒性。Chinnusamy等(2003)在拟南芥中分离得到了转录因子ICE1基因，它是CBF基因的转录激活因子(inducer of CBF expression)，它能和CBF的启动子部分结合并且激活CBF的表达，这一结果证明了在拟南芥CBF转录因子一CRT/DRE基序一COR基因一植物抗寒性级联机制的存在，为CBF调节COR基因表达机理的假说提供了依据。但是关于茶树ICEI转录因子的研究目前只有王玉，等(2011)一篇文章报道而且仅仅只是克隆了该基因的序列，对它的表达分析特性未做详细深入的研究，因此采用实时荧光定量PCR研究不同处理条件(温度、激素、干旱)下茶树ICE1基因的表达特性一方面为我们全面深入的开展茶树ICE1的研究提供基础数据，另一方面使其作为茶树基因工程育种的一个备选基因，为将来选育抗寒能力强的茶树品种提供可能。

发明内容

本发明的目的之一是为全面了解茶树ICE1基因的表达特性而设计的不同处理条件(不同温度、不同激素和干旱)和不同的取样时间。

本发明的另一目的是提供一种高效快捷检测ICE1基因表达量的新型实时荧光定量PCR方法。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

对茶树进行4℃诱导(放置于光照培养箱，弱光处理)、-5℃诱导(放置于控温冰箱，暗处理)、ABA诱导(喷洒200mg/L ABA)、BR诱到(喷洒1mg/L BR)、干旱处理(一次性浇入20％PEG-6000溶液，直至盆底有溶液溢出为准)，处理0min-72h内取样。

设计一对检测茶树ICE1基因表达特性的引物，其特征包括符合荧光定量PCR反应特点的上下游引物：ICE1-F：5「′-GGAGAACCTTGGGCTAGACAT-3′，ICE1-R：5「′-TCTATAGGCATGAGAAAGAGCA-3′；以及作为内参基因的上下游引物：GAPDH：5′-TTGGCATCGTTGAGGGTCTC-3′，GAPDH-R：5′-CATCGACAGTGGGAACACGG-3′。

本发明所述检测茶树ICE1基因表达特性的新型荧光定量PCR法，其特征按照如下步骤进行：

(1)cDNA第一链的合成：提取样本的总RNA并纯化，采用反转录试剂盒得到以提取的RNA为模板反转录得到cDNA；

(2)对下述引物进行常规PCR检测

该基因的荧光定量上下游引物：

ICE1-F：5「′-GGAGAACCTTGGGCTAGACAT-3′，

ICE1-R：5「′-TCTATAGGCATGAGAAAGAGCA-3′

以及作为内参基因的上下游引物

GAPDH-F：5′-TTGGCATCGTTGAGGGTCTC-3′

GAPDH-R：5′-CATCGACAGTGGGAACACGG-3′