[发明专利]一种检测茶树ICE1基因表达特性的新型荧光定量PCR法

权利要求书

1.一种检测茶树ICE1基因表达特性的新型荧光定量PCR法的不同处理条件，其特征包括：低温处理(4℃、-5℃)、激素处理(AB、BR)、干旱处理。

2.一种检测茶树ICE7基因表达特性的新型荧光定量PCR法的不同处理条件下的取样时间，其特征包括0min-72h。

3.一种检测茶树ICE7基因表达特性的新型荧光定量PCR法的特异性引物，其特征包括符合荧光定量PCR反应特点的上下游引物：

ICE1-F：5「′-GGAGAACCTTGGGCTAGACAT-3′，

ICE1-R：5「′-TCTATAGGCATGAGAAAGAGCA-3′；

以及作为内参基因的上下游引物：GAPDH-F：5′-TTGGCATCGTTGAGGGTCTC-3′，GAPDH-R：5′-CATCGACAGTGGGAACACGG-3′。

4.一种采用权利要求3所述特异性引物检测权利1和2要求的茶树ICE1基因表达的特性的方法，其特征在于按如下步骤：

(1)cDNA第一链的合成：提取样本的总RNA并纯化，采用反转录试剂盒得到以提取的RNA为模板反转录得到cDNA；

(2)对下述引物进行常规PCR检测

该基因的荧光定量上下游引物：

ICE1-F：5「′-GGAGAACCTTGGGCTAGACAT-3′，

ICE1-R：5「′-TCTATAGGCATGAGAAAGAGCA-3′

以及作为内参基因的上下游引物

GAPDH-F：5′-TTGGCATCGTTGAGGGTCTC-3′

GAPDH-R：5′-CATCGACAGTGGGAACACGG-3′

常规PCR扩增体系如下：

 Components   Vblume(μl)  Master Mix   12.5  Forward Primer   2  Reverse Primer   2  cDNA   2  Water   6.5  Total Vblume(μl)   25

常规PCR反应程序如下：

(3)实时荧光定量反应：

以步骤(1)得到的cDNA为模板，加入步骤(2)所述的引物，进行荧光定量PCR程序、溶解曲线程序和冷却程序反应，每个样品设置≥3个平行，扩增后取平均值。

实时荧光定量PCR扩增体系如下；

  Components  Volume(μl)   SYBR Green qPCR Master Mix   10   Forward Primer   0.8   Reverse Primer   0.8   cDNA   2   Water   6.4   Total Volume(μl)   20

实时荧光定量PCR反应程序如下：

溶解曲线反应程序为：

95℃5s

65℃1min

冷却反应程序为：

40℃30s。