[发明专利]miR-21小分子抑制剂及应用

说明书

技术领域

微小RNA(microRNA或miRNA)是指长度约21～25nt的某些特殊的小型非编码RNA组成的家族,这些miRNA能够识别特定的目标mRNA,并在转录后水平通过促进靶mRNA的降解和/或抑制翻译过程而发挥负调控基因表达的过程,并与个体发育、干细胞分化和疾病发生密切相关。miRNA最初的转录结构是一个发夹结构的pri-miRNA，经过Drosha酶加工后得到pre-miRNA，通过依赖RanGTP/exportin5(Exp5)的转运机制完成pre-miRNA转运出核，经过Dicer酶切后pre-miRNA降解成约22nt的单链RNA形成成熟的miRNA；成熟的miRNA在RISC中能够识别特定的目标mRNA的3`UTR区域。每个miRNA具有数十种到甚至更多的蛋白表达调控靶点,而每一种蛋白表达有可能同时受到多个miRNA的调控。miRNA在大小、结构和功能方面存在着高度的保守性，组成了物种进化过程中细胞高度复杂的RNA表达调控网络。目前研究发现，miRNA在肿瘤、心脑血管疾病、免疫系统疾病等中存在着特异性的表达谱。因此，miRNA在以上相关疾病的发病机制、早期诊断以及寻找新的治疗策略的研究中意义重大。

背景技术

miR-21是较早发现的人类miRNA之一，与许多种肿瘤和心脑血管疾病关系密切。以胶质瘤为例，Ciafrè等人通过对胶质瘤手术标本以及胶质母细胞瘤细胞系的miRNA表达谱的分析，证实miR-21作为表达上调的miRNA代表，在胶质瘤组织中的表达水平是瘤周“正常组织”表达水平的1.8~9.3倍；而在胶质母细胞瘤细胞系中，其表达水平比正常脑组织表达水平要高1.6倍。反义miR-21下调miR-21表达水平，可以使胶质瘤细胞增殖侵袭能力下降，肿瘤细胞凋亡增加，肿瘤体内生长受到抑制。因此，如能有效调控miR-21水平，则极其有助于推动肿瘤和心脑血管疾病的治疗发展。目前，下调miRNA表达水平的方法，主要有化学合成寡核苷酸和构建载体2个方法。化学合成寡核苷酸采用反义miRNA来阻断特定miRNA的活性。对于载体而言，主要是构建质粒或者病毒系统来表达与miRNA前体的茎环结构互补的siRNA。但这些方法因为价格较昂贵，目前大多处于实验室阶段，还无法真正用于临床治疗。因此，发现新的手段来下调miRNA水平，成为极为迫切的研究领域。

发明内容

本发明目的是解决目前下调miR-21方法价格昂贵且未真正应用于临床的问题，提供一种下调miR-21新方法即miR-21小分子抑制剂。

本发明的一种miR-21小分子抑制剂为2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈，化学式为C5H11N5，分子量为141.17434g/mol，是一种六元杂环有机化合物，其碳氮环结构类似于嘧啶，1、3位含有两个氮原子，2、4、5、6号位置上均为碳原子，各原子均由单键连接。2、4号位置上分别连有一个氨基取代基，5号位置上则连有一个腈基取代基。

化学结构式为：

2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈与miR-21接位结合能力Ki=1.49nM,deltaG=-12.04kcal/mol。在筛选的候选化合物中结合能力最强。

miR-21小分子抑制剂2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈抑制剂应用，下调miR-21小分子，抑制肿瘤细胞生长。应用于抑制肿瘤细胞的药物。

miR-21的小分子抑制剂是从美国癌症研究院（NIH）的癌症治疗计划（DTP）中筛选获得。该项目成立于1955年，到目前超过40种美国许可的化学治疗药物是在该项目中获得完成，其中包括最常见的化疗药紫杉醇（Paclitaxel），并且市场上超过70%的抗癌药物的研发也均与该项目有关。此项目数据库目前已拥有超过20万中化学小分子的2D或3D化学结构，提供原药供科研使用。我们利用计算机结构模拟miR-21前体的3D结构，从DTP数据库中筛选与之结合位点匹配度最高的化合物，并经体内外实验进一步验证，确定了化合物2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈为最优的miR-21抑制剂。目前该抑制剂没有商品化，但可以从DTP免费获得。MC-Fold/MC-Sym pipeline是一种常用的RNA二级及三级结构预测的软件。将RNA相关序列输入MC-Fold中可以得到RNA的二级机构，而进一步将此二级结构输入MC-Sym中则会产生对应的三级结构。具体筛选过程如下：