[发明专利]亚全能干细胞分泌的外来体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及亚全能干细胞分泌的外来体及其应用。

背景技术

干细胞是一种具有自我更新和多向分化潜能的细胞。根据这一定义，在个体发育的不同阶段以及成体的不同组织中均存在着干细胞。根据分化潜能的不同，干细胞可分为全能干细胞（totipotent stem cel1）、三胚层多潜能干细胞（pluripotent stem cel1）、单胚层多能干细胞（multipotent stem cel1）和单能干细胞（unipotent stem cel1）。本领域现有技术中也有亚全能干细胞的概念，认为在胚胎发育过程中会有亚全能干细胞存留在人体多种组织中，其分化潜能仅次于全能干细胞，是一种原始干细胞亚群，处于干细胞等级结构的最上层。通过一系列的探索，人们已经从骨髓和脂肪组织中获得了亚全能干细胞，并对它的表型和生物学功能进行了鉴定。亚全能干细胞的特征在于其具有上皮样形态、Flk1⁺表型、无成瘤性且单克隆来源的该细胞在体外具有诱导分化成三胚层来源的组织细胞的能力。

Exosomes（外来体）是一类起源于内吞体系统并被排出细胞外、直径在40～l00nm之间的双层膜性囊泡（1）。外来体可以由多种细胞包括树突状细胞、肿瘤细胞等分泌（2，3）。外来体含有大量与其来源和功能密切相关的蛋白质、核酸和脂质成分，作为细胞间传递信息的重要载体，参与多种病理生理过程，但大多数研究集中在免疫细胞和肿瘤细胞释放的外来体。近年来，干细胞中的外来体也逐渐引起了人们的关注。

本发明拟研究上述亚全能干细胞中是否也有外来体的产生及如果有外来体产生，其特殊的性质及用途。

发明内容

因此本发明的技术目的在于探究亚全能干细胞分泌的外来体及其性质和用途。

因此，本发明的第一方面涉及一种亚全能干细胞分泌的外来体，所述亚全能干细胞呈Flk1阳性，在体外具有诱导分化成三胚层来源的组织细胞的能力。

优选地，所述外来体特异性表达下述microRNA：hsa-miR-3191-5p、hsa-miR-4711-3p和hsa-miR-1273a，优选地，其还特异性表达下述microRNA：hsa-miR-3142、hsa-miR-4456和hsa-miR-4714-5p。

优选地，所述亚全能干细胞的获取步骤如下：

A）常规方法分离aMSC或bMSC或其他组织来源的间充质干细胞，

B）以1个细胞/孔的密度将aMSC或bMSC或其他组织来源的间充质干细胞接种于96孔板中，待长出单克隆后，将这些单克隆进一步扩增，

C）将单克隆进一步扩增后的细胞作为种子细胞，4-6h细胞完全贴壁后加入1号诱导培养基诱导1天后，更换2号诱导培养基继续诱导培养4天，获得亚全能干细胞，即Flk1阳性的MSC，所述1号诱导培养基包含1-100ng/ml活化素A+1-500ng/ml Wnt3a+0.1-20%FBS+HG-DMEM，优选地，5-50ng/ml活化素A，更优选地，10-30ng/ml活化素A；优选地，50-300ng/ml Wnt3a，更优选地，100-300ng/ml Wnt3a；优选地，2-10%FBS，更优选地，5-8%FBS，所述2号诱导培养基包含1-100ng/ml活化素A+1-500μM RA+0.1-50%FBS+HG-DMEM，5-50ng/ml活化素A，更优选地，10-30ng/ml活化素A；优选地，20-400μM RA，更优选地，50-200μM RA，将获得的具有上皮样形态的亚全能干细胞进行免疫细胞荧光染色检测和Western Blot检测，其中所述免疫细胞荧光染色检测的指标包括Foxa2、Sox17、Kdr、Tbx6、Eomes、Gsc、T、Sox1、Pax6，所述Western Blot检测的指标包括Foxa2、Sox17、T、Gsc、Epcam、Vimatin，检测获得的干细胞是否具有三胚层分化潜能重要基因表型标志，即限定性的内胚层：Foxa2、Sox17；中内胚层：Gsc、T、Eomes；中胚层：Kdr、Tbx6；外胚层：Sox1、Pax6，并且具有较高的诱导效率，Foxa2、Sox17阳性的限定性内胚层细胞效率达到90%以上。

优选地，所述外来体通过如下步骤获得：

A）收集亚全能干细胞培养48小时的上清液，