[发明专利]亚全能干细胞分泌的外来体及其应用

权利要求书

1.一种亚全能干细胞分泌的外来体，所述亚全能干细胞呈Flk1阳性，在体外具有诱导分化成三胚层来源的组织细胞的能力。

2.根据权利要求1所述的亚全能干细胞分泌的外来体，其特征在于其特异性表达下述microRNA：hsa-miR-3191-5p、hsa-miR-4711-3p和hsa-miR-1273a，优选地，其还特异性表达下述microRNA：hsa-miR-3142、hsa-miR-4456和hsa-miR-4714-5p。

3.根据权利要求1或2所述的亚全能干细胞分泌的外来体，其特征在于所述亚全能干细胞的获取步骤如下：

A）常规方法分离aMSC或bMSC或其他组织来源的间充质干细胞，

B）以1个细胞/孔的密度将aMSC或bMSC或其他组织来源的间充质干细胞接种于96孔板中，待长出单克隆后，将这些单克隆进一步扩增，

C）将单克隆进一步扩增后的细胞作为种子细胞，4-6h细胞完全贴壁后加入1号诱导培养基诱导1天后，更换2号诱导培养基继续诱导培养4天，获得亚全能干细胞，即Flk1阳性的MSC，所述1号诱导培养基包含1-100ng/ml活化素A+1-500ng/ml Wnt3a+0.1-20%FBS+HG-DMEM，优选地，5-50ng/ml活化素A，更优选地，10-30ng/ml活化素A；优选地，50-300ng/ml Wnt3a，更优选地，100-300ng/ml Wnt3a；优选地，2-10%FBS，更优选地，5-8%FBS，所述2号诱导培养基包含1-100ng/ml活化素A+1-500μM RA+0.1-50%FBS+HG-DMEM，5-50ng/ml活化素A，更优选地，10-30ng/ml活化素A；优选地，20-400μM RA，更优选地，50-200μM RA，将获得的具有上皮样形态的亚全能干细胞进行免疫细胞荧光染色检测和Western Blot检测，其中所述免疫细胞荧光染色检测的指标包括Foxa2、Sox17、Kdr、Tbx6、Eomes、Gsc、T、Sox1、Pax6，所述Western Blot检测的指标包括Foxa2、Sox17、T、Gsc、Epcam、Vimatin，检测获得的干细胞是否具有三胚层分化潜能重要基因表型标志，即限定性的内胚层：Foxa2、Sox17；中内胚层：Gsc、T、Eomes；中胚层：Kdr、Tbx6；外胚层：Sox1、Pax6，并且具有较高的诱导效率，Foxa2、Sox17阳性的限定性内胚层细胞效率达到90%以上。

4.根据权利要求1至3任一项所述的亚全能干细胞分泌的外来体，其特征在于其通过如下步骤获得：

A）收集亚全能干细胞培养48小时的上清液，

B）用差速离心法提取外来体，细胞培养上清液1,000×g，离心10min；取上清，10,000×g离心10min；取上清液，将30％蔗糖／重水垫、上清液及PBS依次放入离心管中，100,000×g，离心1h；取混有外来体的蔗糖／重水垫，用PBS悬浮，加入到100kD超滤离心管中，重复3次，浓缩液即为p-外来体，

C）用0.22μm的滤膜过滤除菌，放入-80℃冰箱中保存备用。

5.根据权利要求1至4任一项所述的亚全能干细胞分泌的外来体，其特征在于所述亚全能干细胞的来源为脂肪组织或骨髓组织。

6.一种含有权利要求1至5任一项所述的亚全能干细胞分泌的外来体的组合物。