[发明专利]一种检测 VEGFR2 mRNA 基因表达量的试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，是一种检测 VEGFR2 mRNA 基因表达量的试剂盒及方法。

背景技术

血管生成是实体瘤细胞生长和转移的必要条件，抑制肿瘤细胞诱导的血管生成已成为近年来寻找新型抗肿瘤药物的重要研究方向。血管内皮细胞生长因子（VEGF）及其受体（VEGFR）是抗血管生成靶向治疗的主要靶标。抗血管生成药物作用机理主要是通过抑制肿瘤细胞诱导的血管生成来达到阻止肿瘤的生长、转移和复发的目的。目前经FDA批准的此类药物包括舒尼替尼、索拉非尼和贝伐单抗等。贝伐单抗（Bevacizumab，Avastin)是一种重组的人类单克隆IgG1抗体，通过抑制人类血管内皮生长因子VEGF的生物学活性，而阻断肿瘤新生血管的形成，抑制肿瘤细胞的生长。2004年经美国FDA批准后，用于结直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤等恶性肿瘤的治疗。

VEGFR (Vascular endothelial growth factor receptor，血管内皮生长因子受体)，迄今已发现的VEGF信号转导的主要受体包括fms样酪氨酸激酶VEGFR-1，即Flt-1(Fms-like tyrosine)，胎儿肝激酶插入区受体VEGFR-2，即KDR/Flk-1(Kinase insert domain-containing receptor)和VEGFR-3(Flt-4)，三者均具有酪氨酸活性，此外还有一些相关受体，如神经纤维网蛋白 (Neuropilin-1,2,NRP-1,2) 等非激酶受体。大量研究证明，VEGFR在正常人体组织中呈低水平表达，而在绝大多数肿瘤中呈现高表达，且VEGF受体不仅表达于血管内皮细胞,还表达于肿瘤细胞，故认为除旁分泌外,还存在自分泌途径。它不仅促进血管内皮细胞分裂、增殖，且诱导肿瘤血管增生，并促使其肿瘤细胞生长转移 (Harada Y, etal. Int J Clin Oncol. 2001 Oct;6(5):221-8) 。

临床研究表明，VEGFR2 (或称KDR) mRNA表达水平检测对结直肠癌患者接受靶向治疗具有明显的指导意义，VEGFR2 低表达的患者中位无进展生存期较短 (AB El-Khoueiry AP et al. J Clin Oncol.2009;27:15s. ) 。因此，对 VEGFR2 表达量实时、准确、定量地检测，有利于临床医生及时、准确、合理的制定个体化治疗方案。

荧光定量PCR技术的出现，为本发明提供了一种操作简单快速、易标准化、检测费用低，准确可靠、定量检测mRNA的方法。通过该方法可以快速检测肿瘤细胞 (来源于肿瘤组织、循环肿瘤细胞、穿刺标本、胸腹水等) 中VEGFR2 mRNA的表达量，用于临床医生对血管生成抑制剂靶向药物 (舒尼替尼、索拉非尼、贝伐单抗等)的合理化使用。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测 VEGFR2 基因mRNA表达量的荧光定量PCR检测试剂盒，能简单快速、准确可靠的检测VEGFR2基因。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

一种检测 VEGFR2 mRNA 基因表达量的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括以下组成部分：

（1）VEGFR2基因标准品：含有VEGFR2基因编码序列的重组载体，所述VEGFR2基因编码序列如SEQ ID NO.1所示；

（2）内对照B2M基因标准品：含有B2M基因编码序列的重组载体，所述B2M基因编码序列如SEQ ID NO.2所示；

（3）检测VEGFR2基因的上、下游引物：

VEGFR2-上游引物：5’- ACTGTCATCCTTACCAATCCCA -3’（SEQ ID NO.3）；

VEGFR2-下游引物：5’- ATCTGGGGTGGGACATACAC -3’（SEQ ID NO.4）；

（4）检测B2M基因的上、下游引物：

B2M-上游引物：5’- CCAAGATAGTTAAGTGGGATCGAGA -3’（SEQ ID NO.5）；

B2M-下游引物：5’- TTCATCCAATCCAAATGCGGC -3’（SEQ ID NO.6）。

进一步，所述含有VEGFR2基因编码序列的重组载体和含有B2M基因编码序列的重组载体的空载体均采用pUC57载体；

进一步，该试剂盒还包含逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液、M-MLV逆转录酶、定量PCR缓冲液和TaqDNA聚合酶中。