[发明专利]一种检测 VEGFR2 mRNA 基因表达量的试剂盒及方法

权利要求书

1.一种检测 VEGFR2 mRNA 基因表达量的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括以下组成部分：

（1） VEGFR2基因标准品：含有VEGFR2基因编码序列的重组载体，所述VEGFR2基因编码序列如SEQ ID NO.1所示；

（2）内对照B2M基因标准品：含有B2M基因编码序列的重组载体，所述B2M基因编码序列如SEQ ID NO.2所示；

（3）检测VEGFR2基因的上、下游引物：

VEGFR2-上游引物：5’- ACTGTCATCCTTACCAATCCCA -3’；

VEGFR2-下游引物：5’- ATCTGGGGTGGGACATACAC -3’；

（4）检测B2M基因的上、下游引物：

B2M-上游引物：5’- CCAAGATAGTTAAGTGGGATCGAGA -3’；

B2M-下游引物：5’- TTCATCCAATCCAAATGCGGC -3’。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述含有VEGFR2基因编码序列的重组载体和含有B2M基因编码序列的重组载体中的空载体均为pUC57载体。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液、M-MLV逆转录酶、定量PCR缓冲液和TaqDNA聚合酶。

4.一种基于权利要求1至3任一项所述试剂盒检测VEGFR2 mRNA基因表达量的方法，包括如下步骤：

（1）从待测标本中提取总RNA，测定RNA浓度，加入逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液和M-MLV逆转录酶，将RNA逆转录为cDNA；

（2）分别将已知拷贝数的VEGFR2和内对照B2M基因标准品倍比稀释至10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10个拷贝数/μl；

（3）分别以步骤（1）所制备的待测cDNA及步骤（2）倍比稀释的VEGFR2基因标准品为模板，加入内对照B2M基因标准品，检测VEGFR2基因的上、下游引物，检测内对照B2M基因的上、下游引物，定量PCR缓冲液，dNTPs溶液以及TaqDNA聚合酶，进行荧光定量PCR；

（4）根据倍比稀释的VEGFR2和内对照B2M基因标准品的循环阈值与初始拷贝数分别绘制VEGFR2和内对照B2M基因标准曲线，再根据待测cDNA的循环阈值，从标准曲线上读取其含有的VEGFR2基因和内对照B2M基因的初始拷贝数。

5.根据权利要求 4 所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）的PCR扩增条件为：95^oC预变性3分钟，然后95^oC变性30秒、57^oC退火40秒，共38个循环。