[发明专利]一种禽腺病毒转移载体及其制备方法

说明书

技术领域：

本发明属于基因工程领域,尤其涉及一种载体，具体来说是一种禽腺病毒转移载体及其制备方法。

背景技术：

腺病毒是目前动物病毒中在形态和化学结构上发明得最为详细的病毒之一，其主要原因是腺病毒没有囊膜，衣壳结构清晰，易在电子显微镜下仔细观察，核酸和蛋白质易分离。而且近年来，部分血清型的腺病毒基因组结构、复制、转录特征已发明得相当清楚，特别是一些腺病毒载体在临床上的成功应用，使得以重组腺病毒为载体参与基因治疗与基因免疫受到普遍重视。

腺病毒作为基因转移载体被广泛应用于基因治疗及重组疫苗发明等领域，但多方面因素阻碍了人腺病毒（hAd）载体作为人和动物基因治疗载体和重组活疫苗的应用，包括人体内预存中和抗体、复制缺陷型和野生型人腺病毒间互补/重组循环污染载体、多种血清型人腺病毒可在动物细胞中复制等。开发动物腺病毒载体可能会解决上述问题。某些动物腺病毒具有转导人源细胞中的能力，并且动物腺病毒由于具有高度种属特异性，虽能进入人体细胞却不能在其中复制繁殖，缺乏与人腺病毒的同源性不会发生共复制和重组，人体内也不存在预先针对它们的免疫应答。因此，应用非人腺病毒载体，结合免疫抑制策略可能成为基因治疗可供选择的途径。对动物而言，以其自身种属的腺病毒载体作为兽用重组疫苗会比用hAd载体更为有效。因此，开发动物腺病毒载体用于基因转移，将具有广阔的应用前景。目前发明得较多的动物腺病毒有牛、猪、犬、鼠、禽类等。近几年来，利用禽腺病毒做载体已成为禽病疫苗发明的热点。禽腺病毒属主要包括过去根据群特异性抗原差异分类的I群禽腺病毒，包括传统禽腺病毒及分离自鸡、火鸡、鹅和其它禽类的腺病毒，共12个血清型，享有一种共同的群抗原。由于I群禽腺病毒多数呈隐性感染，不引起明显临床症状，被认为是活病毒载体的候选株。

禽腺病毒载体与其他病毒载体比较，具有许多独特的优点：⑴致病性低，安全性好,在机体内复制不整合到宿主细胞染色体中，无插入致突变性,未发现其与人类肿瘤的发生有直接关系。⑵靶细胞种类较为广泛，并且能感染繁殖期、静止期和高度分化的细胞和高水平表达外源基因，并且在受体细胞中能高效复制。⑶腺病毒粒子相对稳定，就目前常用载体的血清型而言，病毒基因组重排频率低，外源基因片段插入片段在病毒连续复制几个周期后一般仍保持不变，腺病毒基因组相对易于进行重组DNA技术操作。⑷可以在肠道及呼吸道繁殖，可制成药囊经口服途径接种，应用方便。⑸能在鸡胚或细胞中有效增殖，病毒滴度高。⑹禽腺病毒基因组较大，插入大片段外源性基因的潜力大。

在较早的发明中，对CELOV基因组的限制性片段图谱和病毒结构蛋白已有详细报告。Susanna Chiocca等完成了I型禽腺病毒代表种鸡胚致死孤儿病毒CELOV的基因组全序列测定工作。编码主要的病毒结构蛋白的基因（Ⅲa、pentonbase、hexon、pⅥ和pⅧ）以及编码52k、100k蛋白的基因、E2区基因、Ⅳa2基因，均在基因组预期位置出现。

Anne-isabelle Michou等对禽腺病毒CELOV基因组进行突变发明，结果鉴定了一系列可被缺失但需通过反式提供调节因子修复复制的病毒复制必需区和一个复制非必需区。此外，该发明还证实CELO载体可以与Ad5一样有效转导多种哺乳动物细胞，有望替代基于Ad5载体用于哺乳动物转基因发明。同时由于禽腺病毒与牛、羊、犬等其他动物腺病毒一样，对人源细胞天然存在复制缺陷，即使在人腺病毒存在的情况下，也不能在人源细胞内大量复制存在，因此有较高的生物安全性。

DY Logunov等探讨了利用禽腺病毒CELOV载体作为转基因工具的可能性。他们构建了一系列重组CELO病毒并证实即使在体内已有针对Ad5的免疫反应的情况下它们也能很好的将基因转入各种器官内。产生的CELO-p53载体修复了p53抑制肿瘤活性的功能，它们既能在体外人的肿瘤细胞中也能在移植裸鼠体内的异种移植物中发挥抗肿瘤活性，在裸鼠身上甚至伴随抑制肿瘤生长的作用。

非人源腺病毒载体在基因治疗方面具有较好的免疫学特性，但常常不能有效转导人源细胞。Stevenson等探索了用非基因性的聚合体包装CELOV，并用碱性成纤维生长因子（bFGF-pc-CELOluc）重建靶向，实现了有效的靶向性改造。Claire Barra等为开发辅助病毒依赖型CELOV载体用作禽源疫苗，初步鉴定了CELOV的顺式作用元件。结果表明基因组左末端nt200-250和nt250-300的区域对病毒包装分别起着很重要和必需的作用。