[发明专利]一种禽腺病毒转移载体及其制备方法

权利要求书

1.一种禽腺病毒转移载体，由一个载体构成，其特征在于：在所述的载体中插入有FAV I-AV208株基因组非必需区的左侧翼序列nt39294-40064和右侧翼序列nt43045－43747。

2.如权利要求1所述的一种禽腺病毒转移载体，其特征在于：所述的载体为PUC18质粒，所述的FAV I-AV208株基因组非必需区的左侧翼序列nt39294-40064插入在PUC18质粒的EcoRⅠ和 SpeⅠ酶切位点之间，所述的FAV I-AV208株基因组非必需区的右侧翼序列nt43045－43747 插入在PUC18质粒的SpeⅠ和 Hind Ⅲ酶切位点之间。

3.如权利要求2所述的一种禽腺病毒转移载体，其特征在于：在所述的FAV I-AV208株基因组非必需区的左侧翼序列nt39294-40064和右侧翼序列nt43045－43747之间插入有一个eGFP基因表达盒，所述的eGFP基因表达盒是一个含有hCMV、MCS、eGFP、SV40早期转录polyA信号的序列片段。

4.如权利要求3所述的一种禽腺病毒转移载体，其特征在于：所述的基因表达盒通过SpeⅠ酶切位点分别和所述的FAV I-AV208株基因组非必需区的左侧翼序列nt39294-40064和FAV I-AV208株基因组非必需区的右侧翼序列nt43045－43747连接。

5.如权利要求4所述的一种禽腺病毒转移载体，其特征在于：所述载体的基因序列如SEQ ID NO：11所示。

6.一种宿主细胞，其特征在于：含有权利要求1所述的禽腺病毒转移载体。

7.权利要求1所述的一种禽腺病毒转移载体的制备方法，其特征在于：包括一个从感染FAV-I AV208株的LMH细胞中获得禽腺病毒基因组的步骤；还包括一个PCR扩增禽腺病毒复制非必需区的步骤，在一个PCR扩增禽腺病毒复制非必需区的步骤中，选取 FAV I-AV208株基因组nt39294-40064及nt43045-43747的序列片段作为欲缺失复制非必需区的左侧翼序列片段和左右侧翼序列片段，采用引物SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6扩增左侧翼序列片段，采用引物SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8扩增右侧翼序列片段；还包括一个中间载体的构建及鉴定的过程，依次将欲缺失复制非必需区的左侧翼序列片段、右侧翼序列片段克隆至pUC18质粒，构建携带左右同源重组臂的中间载体pUC-L-R；还包括一个 eGFP基因表达盒的PCR扩增、克隆的步骤，在一个 eGFP基因表达盒的PCR扩增、克隆的步骤，设计引物SEQ ID NO :9和SEQ ID NO :10，扩增包括hCMV、MCS、eGFP、SV40早期转录polyA信号在内的基因表达盒，基因表达盒与pMD18-T载体连接并转化大肠杆菌感受态，提取质粒后测序，命名为pMD-eGFP载体；还包括一个表达eGFP蛋白的转移载体pUC- LR- GFP的构建步骤，将pMD-eGFP载体与pUC-L-R载体同时进行SpeⅠ酶切后连接，并转化大肠杆菌感受态，得到转移载体pUC-LR-eGFP。

8.如权利要求7所述的一种禽腺病毒转移载体的制备方法，其特征在于：在一个PCR扩增禽腺病毒复制非必需区的步骤中，通过PCR扩增得到的左、右同源重组臂分别经EcoRⅠ/ SpeⅠ和SpeⅠ/ Hind Ⅲ 双酶切后，与经EcoRⅠ/ Hind Ⅲ双酶切处理的pUC18质粒相连接，同源重组臂之间通过共有的SpeⅠ位点相连接，缺失了两者之间的2980bp欲缺失的复制非必需序列。

9.如权利要求7所述的一种禽腺病毒转移载体的制备方法，其特征在于：还包括一个对转移载体pUC-LR-eGFP进行鉴定及测序的步骤，在一个对转移载体pUC-LR-eGFP的鉴定及测序的过程中，先后利用菌落PCR和酶切的方法对EGFP表达盒的连接方向进行筛选鉴定和确认鉴定，得到阳性克隆后测序，测序结果返回后，利用生物学软件DNASTAR对转移载体的核苷酸序列进行比对。

10.一种重组病毒，由一个FAV I-AV208株构成，其特征在于：在所述的FAV I-AV208株中用权利要求3所述的包括hCMV、MCS、eGFP、SV40早期转录polyA信号在内的基因表达盒替代了FAV I-AV208株基因组非必需区2980bp的序列片段。