[发明专利]一种利用胡萝卜愈伤组织繁殖和培养保存针线虫的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用植物愈伤组织繁殖和保存植物寄生线虫的人工培养方法，具体涉及一种利用胡萝卜愈伤组织繁殖和培养保存针线虫的方法。

背景技术

针线虫（Paratylenchus spp.）隶属于垫刃目（Tylenchida）垫刃亚目（Tylenchina）环总科（Criconematoidea）半穿刺科（Tylenchulidae）针亚科（Paratylenchinae），是一类外寄生植物线虫，主要侵染寄生植物的根和其他地下组织，影响植物的正常生长，导致产量和品质的下降。对针线虫的生物学、病理学、生态学和防治方法等进行测定和系统研究，需要有大量纯化的个体并予以长期保存，这就必须对针线虫进行人工繁殖和培养。曾有研究利用白三叶（Trifolium repens）的愈伤组织培养突出针线虫（Paratylenchus projectus），该方法需先在植物组织培养基上培养出愈伤组织再接种培养针线虫，过程繁琐，培养周期长；又由于组织培养基的存在，培养过程对无菌条件的要求很高，而针线虫作为植物外寄生线虫，比内寄生线虫更难做到表面的无菌消毒，该方法在培养过程中使用HgCl₂溶液和双氯苯双胍己烷溶液对线虫进行表面消毒，消毒液浓度过低无法达到该方法所要求的消毒效果，而高浓度的HgCl₂却会严重影响针线虫的生物活性。总之利用白三叶的愈伤组织培养针线虫的方法耗时耗力，各个环节的污染率较大，获得纯化线虫的效率低。

发明内容

本发明的目的在于针对针线虫人工繁殖和培养保存现有技术中的上述不足，提供一种利用胡萝卜愈伤组织繁殖和培养保存针线虫的方法，该方法可实现简单、高效大量繁殖针线虫的目的，同时还能长期保存针线虫并保持针线虫对植物的寄生性和致病性。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种利用胡萝卜愈伤组织繁殖和培养保存针线虫的方法，包括如下步骤：

（1）制备胡萝卜愈伤组织：无菌条件下将干净的胡萝卜用酒精浸泡后灼烧，再将胡萝卜去表皮后切成薄片放入灭菌培养皿中，封口，放入培养箱培养至胡萝卜片长出愈伤组织。

（2）针线虫的消毒和接种：将针线虫用硫酸链霉素溶液消毒后，离心收集针线虫，用无菌水洗涤针线虫，再离心收集针线虫，最后用无菌水制备针线虫悬浮液，将针线虫悬浮液滴在胡萝卜愈伤组织上。

（3）针线虫的繁殖和培养保存：将接种了针线虫的胡萝卜愈伤组织放入培养箱培养。

上述利用胡萝卜愈伤组织繁殖和培养保存针线虫的方法，还包括线虫继代培养的步骤，是用无菌水或0.2～0.3wt%硫酸链霉素溶液清洗培养针线虫的培养皿中的线虫，或用贝曼漏斗法分离胡萝卜愈伤组织上的针线虫，再重复步骤（2）和（3）的操作，即消毒、离心、接种培养。

步骤（1）中所述的胡萝卜优选为新鲜胡萝卜，所述的新鲜胡萝卜为健康、无伤、采收2周以内的胡萝卜。

步骤（1）中所述的酒精优选为90%（V/V）以上酒精。

步骤（1）中所述的培养的条件优选为25～27℃黑暗培养。

步骤（1）所述的制备胡萝卜愈伤组织的方法优选为：将新鲜胡萝卜洗净晾干，在超净工作台中用95%（V/V）工业酒精中浸泡2min后灼烧，并重复2～3次，用无菌刀削去表皮，将胡萝卜切成约5mm左右薄片，放入灭菌培养皿中，封口，放入培养箱中于25℃黑暗培养至胡萝卜片长出愈伤组织。

步骤（2）中所述的针线虫的消毒优选为使用0.2～0.3wt%硫酸链霉素溶液表面消毒6～12h。

步骤（2）中所述的离心的条件优选为4500～5000rpm离心2～5min，更优选的，所述的离心条件为4700rpm离心3min。

步骤（3）中所述的繁殖的条件优选为将接种了针线虫的胡萝卜愈伤组织放入培养箱23～27℃黑暗培养8～10周；更优选的，所述的繁殖的条件为将接种了针线虫的胡萝卜愈伤组织放入培养箱25℃黑暗培养8～10周。

步骤（3）中所述的培养保存的条件优选为将接种了针线虫的胡萝卜愈伤组织放入培养箱22～25℃黑暗培养保存16周以上；更优选的，所述的培养保存的条件为将接种了针线虫的胡萝卜愈伤组织放入培养箱23℃黑暗培养保存16周以上。