[发明专利]抗菌肽LP基因转化酵母的发酵生产方法

说明书

技术领域

[0001] 本发明属于生物发酵领域，更具体地说是关于一种抗菌肽LP基因转化酵母的发酵生产方法。

背景技术

[0002] 抗菌肽LP基因是根据人源天然抗菌肽LL-37和猪源抗菌肽PG-1基因的氨基酸序列设计而人工合成的基因。由于抗菌肽的杀菌机理独特，病原菌不易对其产生抗药性，且抗菌谱广，因此，抗菌肽作为一种新型环保抗菌饲料添加剂，对畜牧业的健康、可持续发展具有重要意义。而目前为止，国内还没有该基因工程菌的发酵生产方法。

发明内容

本发明提供了一种抗菌肽LP基因转化酵母的发酵生产方法。将含抗菌肽LP基因质粒转化的基因工程酵母在适宜的条件下成功表达抗菌肽基因并分泌抗菌肽到菌体外。方法的工艺主要包括摇瓶种子的制备、发酵罐培养，具体工艺过程如下：

（1）摇瓶种子的制备：将含抗菌肽LP基因质粒转化的酵母作为菌种接入三角瓶中，在28-30℃，摇床转速180-300转/分的条件下，培养24-36小时得到摇瓶种子；

（2）发酵罐培养：将（1）中已培养好的种子接入发酵罐，接种量为2-10%，在28-30℃，搅拌速率200-700转/分，罐压0.1-0.4兆帕，风量1:1.2-1:1.4体积/体积/分，pH 5.0-7.0的条件下，培养24-72小时。将发酵所得抗菌肽在100-120℃下加热10-20分钟；

其中所用的摇瓶种子培养基组分及重量百分含量为：蛋白胨2%、酵母粉1%、YNB 1.34%、生物素0.4mg/L、甘油1%、磷酸盐缓冲液100mmol/L。

发酵培养基1L含：85%磷酸26.7mL，CaSO₄·2H₂O 0.93g，K₂SO₄ 18.2g，MgSO₄·7H₂O 14.9g，KOH 4.13g，甘油 40.0g，PTM1溶液4.35mL，28%氨水调pH至5.0。PTM1溶液1L含：CuSO₄·5H₂O 6.0g，Na₂I 0.08g，MnSO₄·H₂O 3.0g， Na₂MoO₄·2H₂O 0.2g，H₃BO₃ 0.02g，COCl₂·6H₂O 0.5g，ZnCl₂ 20.0g，FeSO₄·7H₂O 65.0g，生物素0.2g，硫酸5.0 ml。

当发酵生产时菌种用量超过5升时，方法的工艺主要包括摇瓶种子的制备、种子罐培养和发酵罐培养，具体工艺过程如下：

（1）摇瓶种子的制备：将含抗菌肽LP基因质粒转化的酵母作为菌种接入三角瓶中，在28-30℃，摇床转速180-300转/分的条件下，培养24-36小时得到摇瓶种子；

（2）种子罐培养：将（1）中摇好的摇瓶种子接入种子罐中，接种量1-10%，在28-30℃，搅拌速率200-700转/分，罐压0.1-0.4兆帕，风量1:1.2-1:1.4体积/体积/分，pH 5.0-7.0的条件下，培养24-48小时；

（3）发酵罐培养：将（2）中已培养好的种子接入发酵罐，接种量2-10%，在28-30℃，搅拌速率200-700转/分，罐压0.1-0.4兆帕，风量1:1.2-1:1.4体积/体积/分，pH 5.0-7.0的条件下，培养24-72小时。将发酵所得抗菌肽在100-120℃下加热10-20分钟；

其中所用的摇瓶种子培养基组分及重量百分含量为：蛋白胨2%、酵母粉1%、YNB 1.34%、生物素0.4mg/L、甘油1%、磷酸盐缓冲液100mmol/L。