[发明专利]集成基因代谢和重排构建工业酿酒酵母工程菌的方法

说明书

本申请为申请号201110293244.X、名称为“低甘油合成、高酒精耐性的工业酿酒酵母菌株及其应用”的发明专利的分案申请。 

（一）技术领域

本发明涉及一种集成基因代谢工程和全基因组重排构建工业酿酒酵母工程菌的方法。 

（二）背景技术

酒精浓醪发酵，简单来说就是发酵过程中的高浓度发酵，具体表现在生产有以下特点：1、高酒份；2、高渗透压；3、高酵母数。就酒精生产而言，不同原料、不同时期浓醪发酵的界限存在着明显的差别；大概区分如下：淀粉质原料：酒精浓度在14～16%（V/V），糖蜜原料：酒精浓度在10～12%（V/V）。 

实现酒精浓醪发酵技术，可极大地提高设备利用率、减少工艺用水、降低蒸煮蒸馏能耗和生产成本，对提高乙醇生产的效率与经济和社会效益具有重要现实意义和应用价值。与常规酒精发酵相比，酿酒酵母在浓醪发酵过程中，不仅面临着更加严峻的环境胁迫（高渗、高酒精胁迫等），还会因甘油、乙酸等副产物生成的增多而降低葡萄糖乙醇转化率。因此，为达到工业化生产对发酵速率、乙醇产量和糖醇转化率等技术指标的要求，选育副产物合成低并具有高耐性的工业酿酒酵母菌株是突破浓醪发酵技术瓶颈的关键所在。 

甘油是酿酒酵母发酵生产乙醇过程中主要的副产物，约消耗4%～ 10%的总碳源，如这些碳源用于生成乙醇，全球每年无需增加成本即可增产乙醇13亿升。目前，对酵母细胞甘油代谢途径已研究比较透彻，应用基因代谢工程技术对甘油合成相关的基因及途径进行修饰和改造，可以有效降低甘油的合成，但改造菌株在发酵过程中对高糖、高浓度乙醇等胁迫因子耐受性下降，生长缓慢，进而引起发酵速率降低、发酵周期延长及乙醇产量降低等不良现象。针对一个或少量基因调控、机制已知的性状，基因代谢工程方法是较容易和直接的可行性理性策略，但对于涉及多个基因及其调控网络的复杂性状（如发酵速率、耐受性等发酵性状），基因代谢工程技术很难达到预期效果，甚至会引起菌株关键性能的退化衰变。目前，已有研究应用基于全基因组水平的盲目育种技术——全基因组重排，有效改良菌株的耐乙酸、耐高浓度乙醇等耐受性，但改造菌株的其他生产性能如糖醇转化率提高并不显著，而且随着醪液可发酵性碳源的增加，副产物合成也增加，极大限制了乙醇产量的提高。 

综上所述，应用单一的育种手段虽然能够改良菌株某一方面的性状，但很难获得性能全面的优良菌株，而且容易导致生产菌株关键性能的退化衰变。要从根本上突破浓醪发酵技术瓶颈，获得性能全面的优良酿酒酵母菌株，还是需要结合不同的工业微生物育种策略优势，实现优劣互补，集成创新，更有效、快速地进行工业生产菌株的改良。 

（三）发明内容

本发明的目的是提供一种集成基因代谢工程与全基因组重排技术改良菌株多种生产性能的方法。 

本发明采用的技术方案是： 

一种集成基因代谢工程和全基因组重排构建工业酿酒酵母工程菌的 方法，所述方法包括： 

（1）诱导酿酒酵母菌株产孢，分离纯化单倍体菌株，鉴定单倍体菌株交配型，选取交配型a的单倍体菌株Y1和交配型α的单倍体菌株Y2作为出发菌株； 

（2）然后分别敲除菌株Y1和菌株Y2的编码甘油转运蛋白的基因FPS1，并在FPS1位点整合表达变链球菌（Streptococcus mutans）的3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPN），对单倍体Y1和Y2分别采用G418^r和Zeo^r抗性标记筛选，获得单倍体基因工程菌株：G418^r抗性菌株YFG1（MATa,fps1Δ::PGKp-gapN）和Zeo^r抗性菌株YFG2（MATα,fps1Δ::PGKp-gapN）； 

（3）分别使用紫外和EMS对菌株YFG1和菌株YFG2进行诱变，获得四个突变库：YFG1紫外诱变库、YFG1EMS诱变库、YFG2紫外诱变库和YFG2EMS诱变库； 

（4）以体积浓度8%的乙醇YPD平板筛选生长迅速的单菌落进行第一轮全基因组重排，用含300μg/mL G418和50μg/mL Zeocin的YPD平板筛选重排子，诱导重排子产孢破壁后，用体积浓度12%的乙醇YPD平板筛选生长迅速的单菌落进行第二轮全基因组重排，用含300μg/mLG418和50μg/mL Zeocin的YPD平板筛选重排子，通过模拟工业原料的浓醪发酵测试，获得低副产物合成、高糖醇转化率和高乙醇产量的工业酿酒酵母工程菌株。