[发明专利]鱼类头肾组织来源细胞系的建立方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种体外培养的鱼类细胞系的方法，属于生物细胞培养技术领域。

背景技术

体外培养的鱼类细胞系是广泛应用于病毒学、免疫学、毒理学、发育生物学、肿瘤学基因组学、遗传学以及资源保护等方面的重要工具。截至目前已相继建立近280余株不同鱼类细胞系，在生理学、病毒学、毒理学、肿瘤及基因工程等领域发挥重要作用。

半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis Gunther）在我国主要分布于渤海、黄海海域，其肉质细腻、鲜美，营养丰富，经济价值高，自然资源量少。半滑舌鳎自2003年人工繁殖获得成功后，近年来已经成为我国北方主要的养殖种类，养殖年产值超过10亿元。随着养殖业的快速发展，鱼病给养殖业造成巨大损失，病原包括细菌、病毒、寄生虫等。对半滑舌鳎致病病原特性和免疫抗病基因功能的研究是从根本上解决病害问题的方法，细胞系作为一种体外培养系统，因其成本低、试验重复性好、条件可精确控制的优点，是其中必不可少的研究工具。

迄今为止，虽然有文献报道半滑舌鳎胚胎细胞系（中国水产研究院黄海水产研究所，沙珍霞，Acta Oceanologica Sinica .vol.29.No.2:81-87）、心肌细胞系（中国水产研究院黄海水产研究所，王贤丽，Fish Physiol Biochem  36:1181–1189）、肝脏细胞系（中国水产研究院黄海水产研究所，任国诚，High technology communication.18（6）：657-660）、精巢细胞系（中国水产研究院黄海水产研究所，张博，Int.J.Biol.7(4):452-459）等4个细胞系的建立，但是仍未见头肾来源细胞系的报道。

头肾（又名前肾）是鱼类的主要免疫器官，建立半滑舌鳎头肾来源体外细胞系，可以更有针对性地研究病原在体外培养条件下的致病机理，也可以为研究免疫抗病基因功能提供细胞平台。

发明内容

本发明的目的在于提供一种建立鱼类头肾来源细胞系的方法。本发明所要解决的技术问题是：通过选择细胞培养液，选取合适头肾组织经过原代培养和传代培养，获得可以连续传代，且细胞能维持良好生长状态的头肾来源细胞。作为优选的，本发明的鱼类是半滑舌鳎。

本发明提供的技术方案是：一种鱼类头肾组织来源细胞系的建立方法，包括以下步骤：

1、头肾组织的处理：将头肾组织剪成小块，加入胰蛋白酶进行消化，加入，细胞培养液终止消化，收集经消化处理的组织细胞悬液，离心去除上清；

2、原代培养：加入细胞培养液重悬后于培养箱中培养；

3、传代培养：原代培养细胞开始增殖至组织块周围细胞晕停止生长后，加入胰蛋白酶消化悬起细胞，利用细胞培养液进行传代培养；

优选地，其中所述鱼类为半滑舌鳎。

其中，采用的细胞培养液为在基础细胞培养液中添加胎牛血清、丙酮酸钠、2-巯基乙醇、人碱性成纤维细胞生长因子，优选进一步含有青霉素和/或链霉素。所述基础培养液优选pH为7.0-7.3，更优选为MEM培养基，最佳选用购自GIBCO公司MEM培养基。更具体的是，在使用时向基础细胞培养液中添加上述各种物质。

进一步的，其中胎牛血清添加量为占细胞培养液总体积10-20%的胎牛血清，最佳为20%；丙酮酸钠、2-巯基乙醇、人碱性成纤维细胞生长因子在细胞培养液中的添加量分别达到0.1-5 mM、10-100 mM、1-20 ng/ml，优选为1 mM、50 mM、10ng/ml。青霉素和/或链霉素可按常规量添加，通常添加100 U/ml的青霉素，100 U /ml的链霉素。

上述第2步骤中，所述培养中在24℃培养箱中培养，每隔7天半量更换细胞培养液一次。

上述第3步聚传代培养更优选为：原代培养获得的用添加上述细胞培养液将细胞稀释至2×10⁵细胞/ml浓度进行原瓶传代培养；当瓶底细胞长至单层后在传代中以2×10⁴-2×10⁵细胞/ml浓度进行分瓶接种，传代间隔期为3-7天；传至11代以后，细胞培养液中的胎牛血清含量减为5%-15%。

本发明具有以下有益效果：通过本发明方法建立的细胞系可以在大致室温条件下连续传代，且细胞能维持良好生长状态，可以对其进行冷冻保存，能提供大量的头肾来源细胞。由于于头肾是鱼尤其对于半滑舌鳎而言是重要的免疫器官，因此，所建细胞系为开展病原特性及其致病机理研究、疫苗研制以及功能基因研究等相关领域的理论与应用研究提供了便利。

附图说明