[发明专利]鱼类头肾组织来源细胞系的建立方法

权利要求书

1.一种鱼类头肾组织来源细胞系的建立方法，包括以下步骤：

(1) 头肾组织的处理：将头肾组织剪成小块，加入胰蛋白酶进行消化，加入，细胞培养液终止消化，收集经消化处理的组织细胞悬液，离心去除上清；

(2) 原代培养：加入细胞培养液重悬后于培养箱中培养；

(3) 传代培养：原代培养细胞开始增殖至组织块周围细胞晕停止生长后，加入胰蛋白酶消化悬起细胞，利用细胞培养液进行传代培养；

其中，采用的细胞培养液为在基础细胞培养液中添加胎牛血清、丙酮酸钠、2-巯基乙醇、人碱性成纤维细胞生长因子。

2.按照权利要求1所述的鱼类头肾组织来源细胞系的建立方法，其特征在于：所述的鱼类是半滑舌鳎。

3.按照权利要求1所述的鱼类头肾组织来源细胞系的建立方法，其特征在于：所述基础细胞培养液pH为7.0-7.3。

4.按照权利要求3所述的鱼类头肾组织来源细胞系的建立方法，其特征在于：所述基础细胞培养液为MEM培养液。

5.按照权利要求1所述的鱼类头肾组织来源细胞系的建立方法，其特征在于：在所述基础细胞培养液进一步添加青霉素和/或链霉素。

6.按照权利要求1所述的鱼类头肾组织来源细胞系的建立方法，其特征在于：所述基础细胞培养液中的胎牛血清添加量为占细胞培养液总体积10-20%，优选20%。

7.按照权利要求1所述的鱼类头肾组织来源细胞系的建立方法，其特征在于：所述基础细胞培养液中的添加丙酮酸钠、2-巯基乙醇、人碱性成纤维细胞生长因子在细胞培养液中分别达到0.1-5 mM、10-100 mM、1-20 ng/ml。

8.按照权利要求1所述的鱼类头肾组织来源细胞系的建立方法，其特征在于：所述第2步骤中，所述培养中在24℃培养箱中培养，每隔7天半量更换细胞培养液一次。

9.按照权利要求1所述的鱼类头肾组织来源细胞系的建立方法，其特征在于：所述第3步聚传代培养为：原代培养获得的细胞用添加所述细胞培养液将细胞稀释至2×10⁵细胞/ml浓度进行原瓶传代培养；当瓶底细胞长至单层后在传代中以2×10⁴-2×10⁵细胞/ml浓度进行分瓶接种，传代间隔期为3-7天；传至11代以后，细胞培养液中的胎牛血清含量减为5%-15%。

10.按照权利要求1至9任一项所述的鱼类头肾组织来源细胞系的建立方法获得的细胞系。