[发明专利]一种重组蜈蚣抗昆虫毒素基因及其表达纯化方法和用途

说明书

技术领域

本发明属于DNA重组技术，特别是涉及编码动物蛋白的基因，更为具体的说是涉及一种重组蜈蚣抗昆虫毒素基因、及其表达纯化方法和通途。 

背景技术

蜈蚣(centipede)是节肢动物门Arthropoda唇足纲Chilopoda动物的总称，全世界约有3300种(Edgecombe，G.D.，Giribet，G.，Ann.Rev.Entomol.2007.52，151-170.)。蜈蚣科Scolopendridae蜈蚣(以下所称蜈蚣皆为此类)为其中最凶猛的捕食性动物，主要以昆虫和小型无脊椎动物为食；大型蜈蚣也能捕食蟾蜍、蛇、以至蝙蝠和大鼠等脊椎动物。蜈蚣通过向猎物注入毒液，直接杀死或麻痹猎物而捕食之。与蜘蛛、蝎等捕食性节肢动物一样，在长期的进化过程中，蜈蚣毒液系统发展出了一系列结构独特、性能高效且特异的毒素。然而，与对蜘蛛和蝎各近百种抗昆虫毒素的深入研究相比，人们对蜈蚣抗昆虫毒素的研究相当薄弱(E.F.Schwartz，C.B.F.Mourao，K.G.Moreira，T.S.Camargos，M.R.Mortari，Pept Sci.2012.98(4)：385-405.)，迄今未见一例蜈蚣抗昆虫毒素基因的重组表达。 

最新的研究揭示，蜈蚣毒液中不仅含有高丰度的新型高分子量毒液蛋白/酶类，也含有分子骨架显著不同于已知毒素的多肽类毒素(E.A.B.Undheim等，Toxicon 57(2011)512-524)，包括多种离子通道毒素(Yang等，Mol Cell Proteomics.2012；11(9)：640-50.)，因而被学界称为“新型生物活性分子的丰富来源”。从蜈蚣毒液中分离获得新的高效、特异的昆虫神经毒素基因及其多肽，进而重组表达或通过转基因技术进入相应的受体，在开发新的神经生物学研究试剂和农业与环境害虫的生物防治中，具有广阔的应用前景。 

发明内容

本发明根据少棘蜈蚣天然毒素序列，设计了适合在大肠肝菌中表达的DNA序列，并在大肠杆菌中重组表达，获得了具有明显抗昆虫活性的少棘蜈蚣抗昆虫毒素。 

具体来说，本发明提供了一种重组蜈蚣抗昆虫毒素Scolotoxin-Ssm2.1基因，是序列表中SEQ ID NO1的核苷酸序列，其具体序列为：CAG GTG CTG GTT GAA GAC GAT GTC CCG TTC CCG GAA AAG AAG TTC GCC GAC CGT GGT GAA TGT ATC CGT GCG TGT GCT GCC AAG TTT ACC GAT GGC GAC CTG AGC AAA ATC AAA GAT GTG CTG CCG  CGT TAC TAC AAG TGT GTG TGT TGG TAT TAT CCG ACC TCG TAA。 

同时，本发明还公开了重组蜈蚣抗昆虫毒素Scolotoxin-Ssm2.1基因突变形成至少含有64％的与SEQ ID NO1中的密码子相同的突变体基因。 

根据本发明的发明目的，发明人对预测的少棘蜈蚣天然毒素Scolotoxin-Ssm2a成熟肽的55个氨基酸残基序列按大肠杆菌高表达基因简并密码子的相对使用频率作优化设计，改造了其中36个密码子(占55个密码子的65.5％)的42个位点，使改造后的Scolotoxin-Ssm2.1更适于在大肠杆菌中表达。同时根据重组克隆的需要，在该基因的末端加上限制性内切酶XhoI的识别序列，采用化学合成法合成了全长的Scolotoxin-Ssm2.1成熟肽结构基因，经DNA测序证实合成的基因与设计的完全一致。 

进一步地，本发明公开了一种重组蜈蚣抗昆虫毒素Scolotoxin-Ssm2.1基因的表达纯化方法，包括如下步骤： 

A，构建含有重组蜈蚣抗昆虫毒素Scolotoxin-Ssm2.1基因或含有重组蜈蚣抗昆虫毒素Scolotoxin-Ssm2.1突变体基因的重组质粒pSUMO-M-Scolotoxin-Ssm2.1； 

B，将重组质粒pSUMO-M-Scolotoxin-Ssm2.1转化至宿主细胞中，得到含有重组质粒的工程菌株； 

C，上述工程菌株经IPTG诱导，获得含有重组蜈蚣抗昆虫毒素的菌体； 

D，将上述菌体清洗、离心、超声破碎，收集上清液； 

E，将上清液反复通过Ni²⁺-IDA亲和层析柱纯化，得到融合蛋白； 

F，上述融合蛋白经过SUMO蛋白酶酶切，得到重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2a。