[发明专利]一种利用基因工程提高球孢白僵菌高渗、氧化胁迫抗性和毒力的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及利用基因工程方法改良真菌性状。

背景技术

昆虫病原真菌是一类重要的昆虫病原微生物，是自然界控制昆虫种群的一类重要自然控制因子(Clarkson et al.，1996，Trends Microbiol.，4：197-203；Feng etal.，1994，Biocontrol Sci.Technol.，4：3-34；Roberts et al.，2004，Adv.Appl.Microbiol.，54：1-70)。其中白僵菌(Beauveria)、绿僵菌(Metarhizium)、棒束孢(Isaria)、轮枝孢(Verticillium)等丝孢类真菌由于其显著的流行潜力和生产的便利性，被广泛用于农、林以及卫生害虫的生物防治。而且，与细菌和病毒类昆虫病原微生物通过消化道侵染方式不同，昆虫病原真菌是唯一直接穿透体壁侵染昆虫的微生物，对于控制将口针直接插入植物韧皮部吸食汁液的刺吸式口器害虫如蚜虫、叶蝉、飞虱等具有独到优势(Hajek et al.，1994，Annu.Rev.Entomol.，39：293-322；St.Leger et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：6349-6354)。因此，开发和应用真菌杀虫剂受到国内外的广泛关注，目前全球注册登记的真菌制剂多达170余种，用于防治农、林以及卫生害虫(de Faria et al.，2007，Biol Control，43：237-256)。

然而，真菌制剂在田间应用时，往往受到紫外辐射、干旱、氧化、变化的温度等环境因素的影响，在很大程度上影响了真菌制剂应用效果的稳定性，限制了其应用范围(Braga et al.，Mycol.Res.，105：874-882；Hallsworth et al.，1994，Lett.Appl.Microbiol.，18：8-11；Rangel et al.，2004，J.Invertebr.Pathol.，87：77-83)。如昆虫病原真菌孢子萌发或侵染初期，需要较高的相对湿度(RH＞95％)和适宜的温度(25-28℃)，而田间的干燥环境和变化的温度往往难以满足侵染所需的适宜条件(Hallsworth et al.，Microbiology，141：1109-1115)。可见，揭示真菌制剂环境适应性的分子机制，利用基因工程提升真菌制剂的对环境的适应性或抗逆性，对促进真菌制剂应用具有重要意义。

近年来，随着病原真菌逆境适应性反应分子机理的重视，尝试利用基因工程改良菌株的抗性水平和毒力已成为可能。色素可以增强真菌在不良环境条件下的存活力和竞争力。罗伯茨绿僵菌(Metarhizium robertsii)产生暗绿色孢子，但不产生DHN黑色素，将真菌Alternaria alternate的DHN黑色素合成途径转入绿僵菌显著增强了菌株对紫外辐射和高温(35℃)的耐受力(Tseng et al.，2011，Appl Environ Microbiol，77：4508-4519)。同样，将来源于曲霉Aspergillusfumigatus的酪氨酸酶基因转入球孢白僵菌提高了色素沉积，增强了菌株对紫外辐射的耐受性(Shang et al.，2012，J Invertebr Pathol，109：105-109)。紫外辐射不仅损伤真菌DNA，而且产生活性氧使细胞处于高水平氧化胁迫(Lesser，1996，Limnol Oceanoge，41：271-283)。病原真菌在氧化胁迫下，产生一系列的抗氧化酶是防御细胞受到伤害的重要方式。这些抗氧化酶包括细胞质、线粒体和分泌到胞外的过氧化氢酶(Cat)、过氧化氢酶-过氧化物酶(Cat-Pox)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)及谷胱甘肽系统、过氧化氧化还原蛋白(Tsa)和硫氧还蛋白(Thioredoxin)系统等。在昆虫病原真菌球孢白僵菌中超量表达Mg-SOD编码基因，显著提高了病原菌清除活性氧的能力，增强了紫外耐受性和毒力(Xie et al.，2010，Appl Microbiol Biotechnol，86：1541-1553)。胞内碳水化合物的贮存与病原真菌热耐受性相关。抑制绿僵菌M.acridum海藻糖酶基因表达显著增强了菌株的热耐受性，但对菌株毒力没有影响(Leng et al.，2011，BMC Microbiology，doi：10.1186/1471-2180-11-32)。

目前，有关通过破坏穿膜蛋白编码基因或改变穿膜蛋白基因表达方式增强菌株抗逆性和毒力的研究尚无报道。