[发明专利]一种获得植物候选抗病基因序列的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种获得植物候选抗病基因序列的方法。

背景技术

植物病害是农林业生产的主要限制因子之一，人类克服植物病害的主要途径之一是利用抗性资源，通过传统育种的方法培育抗病品种，但由于植物抗病性的复杂性以及人们对植物与病原互作机制认识的匮乏，再加上传统育种途径本身的局限性，抗病育种一直是农林业生产上的难题。随着分子生物学技术的发展，通过克隆植物的抗病基因，使得人们对寄主与病原相互作用的分子机理的研究得到了迅速发展，为抗病基因在生产上的应用进行了有益的探索并展示了诱人的前景。与传统育种方法相比，通过克隆抗病基因并利用转基因技术培育抗病植物品种，可以大大缩短抗病育种的年限并提高育种效率。获得抗病基因的前提是高效率的获取候选抗病基因序列，经过基因功能的鉴定后从候选抗病基因序列中筛选出与植物抗病性相关的抗病基因，经过甄别后，再有选择的进行下游的转基因育种实验。

获得植物候选抗病基因序列的方法主要有转座子标签技术和图位克隆技术，但是由于多拷贝基因的存在以及插入位点的随机性极大地限制了转座子标签法的应用范围，而图位克隆法需要构建高密度的分子标记遗传图谱,这限制了该方法的广泛应用。随着功能基因组学和生物信息学知识的发展,出现了一些新的候选抗病基因发掘方法，其中利用同源序列法分离克隆候选抗病基因序列成为一条很受重视的途径，但由于抗病基因具有成簇分布的现象，所以需要展开大量工作以确定克隆的候选基因序列片段是否为目的基因，且还存在许多与抗病基因序列同源而却与抗病性无关的基因序列干扰，因此在许多植物（如棉花）中尚未利用同源序列法克隆得到明确的抗病基因。

由于一些植物基因组比较大，遗传连锁图谱不饱和，通过图位克隆方法分离克隆植物候选抗病基因比较困难，而且由于很多植物的遗传转化体系不完善，利用转座子标签技术克隆候选抗病基因还有一定的难度。当前植物候选抗病基因序列的克隆，主要还是采用同源序列法，目前尽管利用同源序列法获得了大量的候选抗病基因序列片段，但是这些序列并不都与抗病性相关,所以确定克隆的基因序列片段是否为目的基因,还需要进行大量的分析工作，且同源克隆一般是从cDNA水平上克隆候选基因，需要提取高质量的RNA进行反转录实验，程序繁琐，RNA的稳定性也不高。

如何快速、有效的发掘获得植物候选抗病基因序列，是开展植物抗病基因克隆工作的前提，对于植物抗病基因全长序列的获得及开展抗病基因工程育种具有重要的作用。

甲基化是真核细胞DNA修饰的方式之一，在植物生长发育及对逆境胁迫响应中起着重要的作用，在DNA序列中有多个位点可发生甲基化。近年来的研究表明，逆境对DNA的甲基化水平会造成影响，许多受甲基化变化诱导的基因与胁迫反应相关，DNA甲基化是目前植物抗逆机制的研究热点之一。甲基化敏感扩增多态性技术是研究基因组甲基化水平的一个有力工具，利用甲基化敏感扩增多态性技术可以分析基因组甲基化程度的变化，还可以对甲基化状态变化的位点进行序列分析。现有研究表明，当植物受到病害胁迫之后，其基因组的DNA甲基化会发生改变，并且病菌诱导的甲基化改变发生在功能基因位点的编码区，这个研究结果给予发明人启示：使用甲基化敏感扩增多态性技术，再结合基于已知植物抗病基因保守结构域序列设计的引物，可以快速、有效的从DNA水平上发掘植物候选抗病基因序列。

发明内容

本发明的目的在于开发了利用抗性基因同源序列引物锚定的甲基化分析技术获得植物候选抗病基因序列的方法，该方法简化了植物病原菌诱导下的常规甲基化敏感扩增多态性分析技术，并结合所设计的抗性基因同源序列引物，可以在基因组DNA水平上快速察觉病菌诱导的基因片段，通过回收、克隆和测序，快速发掘植物候选抗病基因序列。

本发明所述的方法含有以下步骤：

(1)根据已克隆的植物抗病基因保守结构域序列设计抗性基因同源序列引物，所述抗性基因同源序列引物为SEQ ID NO:39～SEQ ID NO:138所示。

(2)提取接种病原菌后的植物基因组DNA，以未接种病原菌或接种清水的植物基因组DNA为对照，进行抗性基因同源序列引物锚定的甲基化敏感扩增多态性分析，具体如下：