[发明专利]一种获得植物候选抗病基因序列的方法

权利要求书

1.一种获得植物候选抗病基因序列的方法，该方法包括：

(1)根据已克隆的植物抗病基因保守结构域序列设计抗性基因同源序列引物；

(2)提取接种病原菌后的植物植株基因组DNA，以未接种病原菌或接种清水的植物基因组DNA为对照，进行抗性基因同源序列引物锚定的甲基化敏感扩增多态性分析，得到受病菌诱导的多态性条带；

(3)回收上述步骤(2)中所述受病原菌诱导的多态性条带，并进行PCR扩增、克隆、测序；

(4)将测定的序列与已知的抗病反应基因进行同源性比对，与已知的抗病反应基因高度同源的序列即为候选抗病基因序列。

2.按照权利要求1所述方法，其特征在于：

所述抗性基因同源序列引物为SEQ ID NO:39～SEQ ID NO:138所示。

3.按照权利要求1所述方法，其特征在于：在接种病原菌后24h～48h之间提取植物植株基因组DNA。

4.按照权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)包括：

(a)采用一组限制性内切酶Hpa II+EcoR I对供试材料基因组DNA进行双酶切，将所得的酶切产物与接头连接；

(b)将上述步骤(a)获得的连接产物作为预扩增模版，使用预扩增引物进行PCR扩增；

(c)将上述步骤(b)获得的预扩增产物作为选择性扩增模版，进行选择性扩增，在选择性扩增中所使用的引物分为三组：抗性基因同源序列引物、EcoR I选择性扩增引物和HpaⅡ/MspⅠ选择性扩增引物，所述EcoRⅠ选择性扩增引物和HpaⅡ/MspⅠ选择性扩增引物都是在常规甲基化敏感扩增多态性分析中所用的选择性扩增引物；将任一抗性基因同源序列引物与任一EcoRⅠ选择性扩增引物组合成引物对，将任一抗性基因同源序列引物与任一HpaⅡ/MspⅠ选择性扩增引物组合成引物对，分别使用上述两种引物对组合来进行PCR扩增；

(d)将上述步骤(c)获得的选择性扩增产物经过电泳分离、染色后进行谱带的观察，统计分析受病原菌诱导的多态性条带和扩增出受病原菌诱导的多态性条带时所用的引物对。

5.按照权利要求4所述方法，其特征在于：

步骤(3)所述的PCR扩增使用的引物为扩增出受病原菌诱导的多态性条带时所用的引物对，所述克隆为T-A克隆。

6.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于：所述植物为棉花，所述病原菌为黄萎病病原菌。