[发明专利]鸡-γ-干扰素基因序列，其重组工程菌及应用

说明书

本申请为专利号为“2011102516266”，名称为“人工合成鸡干扰素基因序列及其重组工程菌的构建与应用”的分案申请。

技术领域

本发明涉及生物程领域，特别是涉及人工合成的鸡干扰素基因序列，一种以酿酒酵母作为受体菌而得到的重组工程菌，其能进行胞内表达生产动物干扰素。

背景技术

酿酒酵母(Sαcchαromyces cerevisiae)是一种良好的营养与保健饲料添加剂，其营养丰富，富含B族维生素、矿物质、消化酶、促生长因子和较齐全的氨基酸。使用酵母添加剂可以提高饲料蛋白含量，刺激有益菌生长，提高机体免疫力，促进营养物质消化吸收和动物生长发育。同时，酿酒酵母也是最早用于基因工程的酵母菌株，是真核生物生物学研究的模式生物，其表达蛋白能有效保持生物学活性，利用酿酒酵母表达系统，人类已经获得一些重要药用蛋白。

鸡α干扰素(ChIFN-α)和鸡γ干扰素(ChIFN-γ)具有高效广谱的抗病毒、免疫调节、抗肿瘤细胞增殖、提高抗逆性和促进生长等多种重要生理功用，是养禽业用来防治鸡新城疫、传染性支气管炎、传染性喉气管炎、传染性法氏囊、减蛋综合征等多种鸡病毒性传染病的重要药物。尽管干扰素的临床价值极高，但是目前因生产的高昂成本却制约着其在畜牧业中的广泛应用。发明内容

针对上述领域中的缺陷，本发明提供一种人工合成的鸡干扰素基因序列，并提供以酿酒酵母作为受体菌而得到的重组工程菌，利用酿酒酵母作为受体菌胞内表达鸡干扰素，酵母发酵产量大，产物不需分离纯化，直接饲喂含有鸡干扰素的酵母饲料重组菌株，可以实现畜牧业中干扰素的低成本供给问题，在提供鸡体营养物质的同时达到提高其免疫力的目的，避免了疫苗注射等繁琐管理和饲喂抗生素等药物带来的畜产品药物残留问题。

一种人工合成的鸡干扰素基因YEChIFNR，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。

一种人工合成的鸡干扰素基因YEChIFNG，其核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。

一种重组表达载体，具有上述人工合成的鸡干扰素基因YEChIFNR，或YEChIFNG，其骨架载体为pYES2/CT。

一种重组工程菌，具有上述人工合成的鸡干扰素基因YEChIFNR，或YEChIFNG，所述受体菌为酿酒酵母菌株INVSc1。

上述重组工程菌生产药用蛋白鸡干扰素的方法，包括如下步骤：

（1）、酵母菌的培养：保种的重组工程菌接种于SC选择培养基上，于30℃，200r/min过夜震荡培养；

（2）、酵母菌的诱导表达培养：当过夜培养的新鲜菌液OD600=0.3-0.5时，离心收集菌体并用含半乳糖的液体诱导培养基重悬，并于30℃、200r/min振荡培养。

所述诱导培养的条件为：诱导12h，重组菌液发酵pH值为3.8-4.0，2.5%的半乳糖浓度。

所述步骤还包括保种的重组工程菌的制备方法，将重组工程菌在YPD筛选培养基培养，菌落PCR筛选，挑取阳性克隆单菌落，SC选择培养基，30℃振荡过夜培养保种。

所述步骤还包括菌体细胞的裂解，所述步骤（2）的酵母菌培养到对数生长期时，取出转速1500rpm/min离心5min收集菌体，灭菌水重悬菌体细胞之后，10000r/min离心30s，得菌体细胞用裂解缓冲液重悬。

所述菌体细胞裂解前液氮冷冻后置–80℃保存备用，裂解缓冲液重悬的OD₆₀₀=50-100。

所述SC选择培养基为：0.8%Ura缺陷培养基粉+2%葡萄糖；所述YPD筛选培养基为：2%胰蛋白胨+1%酵母提取物，2%葡萄糖+60mg/l Amp（氨苄青霉素）；所述诱导培养基为0.8%Ura（尿嘧啶）缺陷培养基粉+2%半乳糖+1%棉子糖或者2%葡萄糖。

本研究通过构建鸡干扰素基因ChIFN的酿酒酵母表达载体，并通过电击法将其转化酵母菌株INVSc1，对重组菌株的pH值、诱导时间和诱导剂浓度等诱导条件进行优化，并对重组蛋白及其生物学活性进行进检测和分析，证明功能基因已在受体菌中获得正确翻译表达，重组ChIFN-α和ChIFN-γ蛋白具有抗病毒活性，为开发具有抗病功能的饲料微生物添加剂奠定了基础。本研究对探索禽流感等病毒性疾病的防治新途径和保证家禽的安全生产具有积极的意义。

本发明通过酿酒酵母生物反应器表达生产动物药用蛋白，极大地降低生产成本，在给动物提供优质蛋白的同时提高机体免疫力。

本发明的总体的技术方案：包括下列步骤：