[发明专利]含鸡传染性法氏囊病病毒亚单位抗原的疫苗组合物及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种含鸡传染性法氏囊病病毒亚单位抗原的疫苗组合物，属于兽药领域。

背景技术

传染性法氏囊病是由传染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal DiseaseVirus,IBDV）导致的一种高度接触性传染病。以法氏囊肿大、肝脏损伤为主要特征，能引起雏鸡的免疫抑制。该病呈世界性分布，我国也时有发生，造成了严重经济损失。

鸡传染性法氏囊病活疫苗主要分为传染性法氏囊病囊体组织灭活疫苗和传染性法氏囊病毒细胞培养灭活疫苗；灭活疫苗目前在市场上存在有20多种，包括2512HEP、LZD228、Lukert、228E、D78及B2等。

IBDV的VP2上至少包含3组抗原表位即中和性抗原表位、非中和性抗原表位及毒力相关性抗原表位，VP2具有血清型特异性位点，并能诱导产生抗病毒的血清中和抗体，是IBDV的主要保护性抗原基因。动物免疫试验表明，大肠杆菌表达的IBDV VP2免疫SPF鸡后在抵抗强毒攻击的同时，会伴随着很强的副作用，可能与疫苗中包括大量的大肠杆菌产内毒素有关。而酵母表达的IBDV VP2免疫SPF鸡后，能够产生特异性抗体，并在一定程度上抵抗超强毒的致死性攻击，但还不能保护法氏囊组织完全不受侵害和损伤，免疫效果尚不如常规灭活疫苗和大肠杆菌产的亚单位疫苗，这可能是与酵母表达的过程中VP2蛋白中的过度糖基化、免疫剂量和佐剂配比等因素有关。

随着我国养鸡业的集约化发展，传染性法氏囊病已成为危害养鸡业的一种主要传染病，变异株和超强株的出现，使该病防制的难度加大，目前虽然研制了多种商品化的弱毒疫苗和灭活疫苗，但其安全性和制作工艺尚有不尽人意之处。如为抵抗超强毒的攻击，使用中强毒力的毒株研制活疫苗，给IBD的防制带来极大的隐患；灭活苗存在着抗原制备的困难。因此，亟需免疫原性好、安全性高的新型疫苗问世。用大肠杆菌、酵母、杆状病毒表达IBDV vp2等系统，普遍存在表达量低，副反应大，保护率不高等缺点。用大肠杆菌表达系统研究开发亚单位疫苗和活菌载体疫苗的研究也进行了多年，但已知的研究结果是，大肠杆菌表达IBDVVP2蛋白无免疫原性或形成不溶性包涵体无法用作疫苗。

Rong J等人（Jun Rong,Taipin Cheng,Xiaona Liu,Taozhen Jiang,Hong Gu,Guolin Zou，预防雏鸡传染性法氏囊病的新型重组VP2疫苗，Vaccine 23(2005)4844–4851）在大肠杆菌中表达出VP2蛋白，请参见图1，蛋白免疫印迹分析重组蛋白，蛋白条带用辣根过氧化物酶标签显色，泳道1和2分别为E.coli BL21/pET28a克隆的可溶性提取物，泳道3和4分别为E.coli BL21/pET28a-VP2克隆的可溶性提取物；并证实VP2亚单位疫苗能有效保护鸡受到高致病性传染性法氏囊病病毒的侵袭。然而，现有技术中存在以下两种问题：

1、现有技术所得到的VP2蛋白多以包涵体形式存在，生产成本高。

2、现有技术纯化后的蛋白中内毒素含量高，会引起严重的负反应。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题是：

1、减少包涵体的形成，增加VP2蛋白的可溶性表达的量，降低生产成本。

2、采用新的纯化技术减少VP2蛋白中内毒素的含量，降低负反应。

本发明的目的在于克服现有技术的不足，将鸡传染性法氏囊病病毒VP2 cDNA克隆到表达载体中，优化重组蛋白分离、纯化技术，提供一种E.Coli VP2菌种和用所述菌种生产IBD基因工程亚单位疫苗和生产IBD基因工程疫苗的方法及应用。

本发明首先要解决的技术问题是将鸡传染性法氏囊病病毒VP2cDNA克隆到表达载体中，提供一种适合在大肠杆菌中高效表达的鸡传染性法氏囊病病毒重组VP2 cDNA。

本发明提供了一种DNA序列，所述序列实质上编码含有SEQ.NO.2的氨基酸序列，本发明中的术语“实质上含有”是指本发明的基因或多肽在保持其功能的范围内，序列号1的核酸序列，序列号2的氨基酸序列可以发生置换、插入或缺失等变异。

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一个含有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的大肠杆菌表达载体及含有所述表达载体的大肠杆菌，并能表达SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质，与Genebank公布的超强毒株VP2基因序列同源性较高。

本发明所要解决的第一个技术问题是通过以下技术途径实现的：

一种重组大肠杆菌表达载体，含有IBDV VP2基因核苷酸序列。