[发明专利]一种提高水曲柳体细胞胚诱导率的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高体细胞胚诱导率的方法。

背景技术

水曲柳(Fraxinus mandshurica Rupr.)属木犀科白蜡树属，是我国东北重要的经济和生态用树种之一。水曲柳材质优良，强度适中，纹理美观，木材利用价值极高，是著名的军事用材和高级家具用材，与胡桃楸、黄菠萝同称为“东北三大硬阔”。同时，水曲柳是东北林区顶级群落红松针阔混交林的重要伴生树种之一。然而，水曲柳的资源历来非常缺乏，加之长期的过渡采伐和不合理利用，其资源已将近枯竭，生态环境问题日益严重。另外水曲柳母树结实情况受环境条件影响很大，种子的供应常有不足。

水曲柳体细胞胚胎发生技术为解决水曲柳种子匮乏和水曲柳优良品系种质保存的问题提供了一个重要的方法和手段。然而水曲柳体细胞胚胎发生还存在很多困难，比如体细胞胚的诱导率和转换率低等问题。目前，水曲柳胚性组织的诱导主要是利用未成熟合子胚(以授粉后9周左右采集的未成熟合子胚为最佳外植体)，体细胞胚诱导率平均在30～35％。并且存在外植体取材时期受季节(每年7月中旬左右，即授粉后9周)和地点(水曲柳母树林或种子园)限制、外植体来源不足(水曲柳母树结实具有大小年和结实间隔期)等问题。若采用成熟合子胚为外植体，则具有易于取材、不受时间地点限制等优点，易于大规模产业化繁殖。但在现有的技术中，以水曲柳成熟合子胚为外植体的体细胞胚诱导率最高才15％，不能满足水曲柳体细胞胚大规模诱导和培养的需求，无法实现水曲柳体细胞胚的工厂化和自动化生产。因此，迫切需要改进现有的水曲柳体细胞胚诱导技术，以提高水曲柳体细胞胚的诱导率，实现水曲柳优良品系的大规模产业化繁殖。

发明内容

本发明目的是为了解决现有水曲柳体细胞胚胎发生技术中存在体细胞胚诱导率低、外植体取材受季节和地点限制、外植体来源不足的问题，而提供一种提高水曲柳体细胞胚诱导率的方法。

提高水曲柳体细胞胚诱导率的方法按以下步骤实现：

一、取水曲柳成熟种子进行消毒处理，然后剥离出合子胚，切取合子胚的单片子叶接种到含1.0～2.0mg/L苄基腺嘌呤(BA)、2.5～5.0mg/L生长素、200～700mg/L酸性水解酪蛋白、75～125g/L蔗糖和6～7g/L琼脂的诱导培养基中，在温度为20～30℃、湿度为40％～70％、无光照的条件下培养2～4周，得胚性组织；

二、将胚性组织接种到含0～2.0mg/L苄基腺嘌呤、0～5.0mg/L生长素、200～700mg/L酸性水解酪蛋白、20～30g/L蔗糖和6～7g/L琼脂的继代培养基中，在温度为20～30℃、湿度为40％～70％、无光照的条件下继续培养2～4周，得各种不同发育时期的体细胞胚，即完成提高水曲柳体细胞胚诱导率的方法；

其中步骤一中诱导培养基为MS1/2培养基或WPM培养基，pH值均为5～6；

步骤一中生长素为2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)或萘乙酸(NAA)；

步骤二中继代培养基为MS1/2培养基或MS培养基，pH值均为5～6；

步骤二中生长素为2，4-二氯苯氧乙酸或萘乙酸。

本发明中提高水曲柳体细胞胚诱导率的方法成本低、操作简单，通过调节体细胞胚诱导培养基中的蔗糖浓度或甘露醇浓度，可调节培养基的渗透压，进而实现对水曲柳体细胞胚诱导率提高的物理调控，使体细胞胚诱导率提高到70％以上(现有的技术中以水曲柳成熟合子胚为外植体的体细胞胚诱导率最高才15％)，单个外植体上的体细胞胚数量达70个以上。本发明可以实现提高水曲柳体细胞胚诱导率、增加体细胞胚数量、提高繁殖效率的目标，而且本发明具有外植体来源广泛，包括新采集的成熟种子、经过各种方法贮藏不同时间的成熟种子均可作为外植体、外植体取材不受季节和地点限制的特点。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式提高水曲柳体细胞胚诱导率的方法按以下步骤实现：

一、取水曲柳成熟种子进行消毒处理，然后剥离出合子胚，切取合子胚的单片子叶接种到含1.0～2.0mg/L苄基腺嘌呤、2.5～5.0mg/L生长素、200～700mg/L酸性水解酪蛋白、75～125g/L蔗糖和6～7g/L琼脂的诱导培养基中，在温度为20～30℃、湿度为40％～70％、无光照的条件下培养2～4周，得胚性组织；