[发明专利]抑制STAT3 和AFP 基因表达的双靶标siRNA 真核表达质粒及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及抑制STAT3和AFP基因表达的双靶标siRNA真核表达质粒及其用途，属于生物医药技术领域。

背景技术

甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）是胚胎期由肝脏、卵黄囊产生的一种糖蛋白，出生后急剧降低。当发生肝脏肿瘤、某些胃肠道肿瘤和某些生殖系统肿瘤时，血清AFP水平又复升高。目前AFP作为一种公认的肿瘤标志物在肿瘤的诊断中具有重要作用。大约有80%的肝癌患者血清AFP升高，是诊断原发性肝癌的常用检查项目之一。有约50%的生殖细胞肿瘤出现AFP阳性，在其它肠胃管肿瘤如胰腺癌或肺癌及肝硬化等患者亦可出现不同程度的升高。其中AFP阳性胃癌发病率占胃癌的5.1%-15%，这种肿瘤恶性程度高，具有细胞形态学像肝癌，易发生肝转移和早期淋巴道转移，侵袭性强，预后差的特点。

近年来研究发现AFP在肿瘤的发生发展中具有重要作用：（1）免疫调节活性：AFP能抑制NK细胞活性及T淋巴细胞依赖的抗原反应，诱导抑制性T细胞的产生，下调单核细胞表面的MHC-II类分子，及抑制肿瘤坏死因子对肿瘤细胞的细胞毒性作用；AFP还能降低肝癌细胞死亡受体的表达，使之逃避淋巴细胞的攻击。（2）促进肿瘤细胞增殖：实验证明，AFP对人肝癌HepG2细胞、H22细胞和Ehrlich腹水癌细胞及宫颈癌HeLa细胞有直接促增殖作用，用AFP（20mg/L）刺激人肝癌细胞Bel 7402发现c-fos,c-jun和N-ras的mRNA量升高，说明AFP能刺激一些与细胞增殖和分化有关的癌基因表达，从而促进肿瘤细胞增殖。提示AFP可能是重要的内源性促肿瘤细胞增殖的自分泌性蛋白质。（3）参与肿瘤细胞凋亡过程：有研究报道AFP通过与AFP受体结合从而阻止肿瘤细胞凋亡。另有研究认为AFP在肿瘤细胞中能通过活化caspase3诱导凋亡。

AFP作为一种胚胎时期或病理状态合成的蛋白质，它伴随着胚胎发育和细胞分裂旺盛过程，在肿瘤发生发展过程中不仅是一种伴随现象，而且是促进肿瘤细胞生长的内源性物质。这一作用可以被AFP单克隆抗体阻断。抑制AFP基因表达的药物和方法将会影响肿瘤细胞的增殖，从而达到抗肿瘤治疗的目的。因此，阻断AFP基因的表达及其生物学活性同时结合其他的治疗手段有可能是一个治疗与AFP相关肿瘤的一个新的策略。

本发明人在AFP阳性胃癌中的研究证实，利用RNAi技术抑制AFP表达对AFP阳性胃癌细胞FU97具有增殖抑制及凋亡诱导作用，同时可能通过下调VEGF表达抑制肿瘤血管生成在肝癌中，研究报道AFP的小干扰RNA（small interference RNA,siRNA）可诱导人肝癌细胞系Huh7的生长阻滞(参见Yang X,Zhang Y,Zhang L,Zhang L,Mao J.Silencingalpha-fetoprotein expression induces growth arrest and apoptosis in humanhepatocellular cancer cell.Cancer Lett.2008 Nov 28;271(2):281-93.Epub 2008 Jul26.)。本发明课题组的研究也发现AFP-siRNA可抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖(参见WangYS,Ma XL,Qi TG,Liu XD,Meng YS,Guan GJ.Downregulation of alpha-fetoprotein siRNAinhibits proliferation of SMMC-7721 cells.World J Gastroenterol.2005 Oct14;11(38):6053-5.）。

信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）是一种存在于细胞浆与酪氨酸磷酸化信号通道偶联的双功能蛋白。STAT3在多种肿瘤细胞中被激活，并持续处于高活性状态。它具有抑制细胞凋亡，促进细胞增殖的作用，参与了人类恶性肿瘤的发生、发展和演进，已被公认为一种肿瘤相关基因。大量研究发现，利用反义核酸、STAT3的显性负性异构体以及RNAi技术阻断STAT3的活性及表达可使肿瘤细胞生长受到抑制。