[发明专利]抑制STAT3 和AFP 基因表达的双靶标siRNA 真核表达质粒及其用途

权利要求书

1.抑制STAT3和AFP基因表达的双靶标siRNAs真核表达质粒，其特征是，以pGenesil1.5为载体，利用双靶标siRNA技术，在一个shRNA表达质粒上引入针对STAT3和AFP基因有效的shRNA序列，每个序列有各自的启动子及终止信号且各自独立表达，在高表达的STAT3基因的AFP阳性肿瘤中发挥干扰作用,是用于表达STAT3基因的AFP阳性肿瘤的治疗性物质；

所述的shRNA序列的两个反向重复序列分别是STAT3或AFP基因的干涉靶序列及其反向互补序列；

所述的STAT3、AFP基因的干涉靶序列分别为：①5'-GCAACAGATTGCCTGCATTGG-3'，起始于956位；②5'-CAGGGAGACATTCATGAAC-3'，起始于508位；

所述的STAT3、AFP基因的干涉靶序列的反向互补序列分别为：

5'-CCAATGCAGGCAATCTGTTGC-3'，5'-GTTCATGAATGTCTCCCTG-3'；

STAT3、AFP基因shRNA表达框的loop序列分别为：5'-GGCCGGCGCGC-3'，

5'-CGCGCGCGGGCC-3'；

由以下方法制得：

（1）STAT3和AFP基因双启动子shRNA表达框的构建

a.第一轮PCR：以包含H1和U6启动子的质粒XM-2P为模板，设计PCR引物，在3’引入PCR模板质粒XM-2P的部分序列，用于扩增H1和U6启动子序列，并在上下游引物中分别引入所述的STAT3和AFP基因的干涉靶序列的反向互补序列及loop序列；

上游引物：P1-FW:5’-GGCCGGCGCGC CCAATGCAGGCAATCTGTTGC GGGAAAGAGTGATC-3’，

下游引物：P1-RV:5’-CGCGCGCGGGCC GTTCATGAATGTCTCCCTG GGTGTTTCGTCCTTTC-3’；

b.第二轮PCR：以第一轮PCR为模板，设计PCR引物，在上下游引物中分别引入所述的STAT3和AFP基因的干涉靶序列、RNA聚合酶III终止序列“AAAAA”及限制性内切酶HindIII（AAGCTT）、BamHI（GGATCC），为了便于酶切，在两个内切酶5’端添加了保护性碱基分别为“AGT”和“AT”：

上游引物：P2-FW:5’-AGTAAGCTTAAAAA GCAACAGATTGCCTGCATTGG GGCCGGCGCGC CC-3’，

下游引物：P2-RV:5’-ATGGATCCAAAAA CAGGGAGACATTCATGAAC CGCGCGCGGGCC GT-3’；

c.经过以上两轮PCR，得到STAT3和AFP基因双启动子shRNA表达框，产物结构为：HindIII--shRNA1-H1启动子-U6启动子-shRNA2-BamHI。

（2）将步骤（1）所构建的STAT3和AFP基因shRNA表达框和siRNA表达载体pGenesil1.5同时用HindIII、BamHI双酶切，分别产生插入片段和载体片段，然后进行连接，最后转化到DH5α大肠杆菌，经卡那霉素筛选，挑选单个菌落大量培养，用质粒提取试剂盒提取纯化质粒DNA；得到抑制STAT3和AFP基因表达的双靶标siRNAs真核表达质粒pGenesil1.5-STAT3-AFP；

（3）质粒的鉴定：将步骤（2）提取的质粒DNA琼脂糖凝胶电泳，应用限制性内切酶HindIII、BamHI做酶切鉴定，紫外分光光度计分析测定质粒DNA的浓度和纯度，并进行插入片断测序，以确定STAT3和AFP基因shRNA表达框是否正确插入pGenesil1.5质粒中。

2.权利要求1的抑制STAT3和AFP基因表达的双靶标siRNA真核表达质粒在制备治疗表达STAT3的AFP阳性肿瘤的基因药物中的应用。