[发明专利]肝素酶II在解聚肝素前体制备低分子量肝素中的应用

说明书

（一）技术领域

本发明涉及肝素酶II在解聚肝素前体制备低分子量肝素中的应用，以及一种利用重组肝素酶II解聚肝素前体制备低分子量肝素的方法。

（二）背景技术

肝素是有糖醛酸和D-氨基葡萄糖以α（1→4）糖苷键连接而成的重复双糖单位组成的糖胺聚糖家族中的一员，是具有不同链长即不同分子量的各种大小分子所组成的混合物，其分子量具有多分散性，一般在3000~30000D之间，平均分子量15000D（大约为45个单糖）。作为目前世界上使用最广泛最有效的抗凝抗血栓试剂之一，它用于临床诊断已有60多年的历史。但其副作用也越来越明显，如大量的使用肝素会引起出血、骨质疏松等症状。

低分子量肝素（Low Molecular Weight Heparin，LMWH）是分离肝素得到的一些组分或肝素裂解产生的小片段，它可以克服肝素的一些副作用而仍保持其抗凝抗血栓活性，因此低分子量肝素在临床上得到了广泛的应用。英国药典规定：LMWH是指重均分子量不得大于8000，分子量低于8000的物质不少于60%的肝素。

目前LMWH常用制备方法包括物理分离法和化学裂解法，但其中收率低，环境污染问题却不容忽视。

肝素酶是自然界中唯一一类能够特异性裂解肝素大分子中糖苷键的酶类，可以用来解聚肝素制备低分子量肝素，目前肝素黄杆菌（F.heparinum）中已发现三种肝素酶（Heparinase，简称Hep）：肝素酶I，肝素酶II，和肝素酶III，各有其不同的底物特异性，主要是作用位点不同。目前大量的商业化低分子量肝素是通过以肝素酶部分解聚普通肝素获得，这同样有可能发生肝素污染等危机以及会出现肝素的硫酸化基团丢失或减少。

肝素前体（Heparosan）是某些病原菌荚膜中的糖胺聚糖成分，表达式为[-GlcUA-β(1,4)-GlcNAc-α(1,4)-]n（其中GlcUA是葡萄糖醛酸；GlcNAc是葡萄糖乙酰胺），是构成大肠杆菌K5和巴斯德菌D型的荚膜多糖的成分，利用巴斯德菌D型产生的heparosan的分子量为200~300 KDa，而利用大肠杆菌K5产生的heparosan的分子量为3~150 KDa，更接近于肝素的分子量大小。因此，利用大肠杆菌K5荚膜多糖heparosan作为前体合成肝素以及硫酸乙酰肝素得到人们的广泛关注。

由于酶的特异性，目前肝素酶仅用于解聚肝素，还未有以肝素酶对肝素前体进行解聚的报道。

（三）发明内容

本发明目的是提供肝素酶II解聚肝素前体制备低分子量肝素中的应用，并提供一种利用重组肝素酶II解聚肝素前体制备低分子量肝素的方法。

本发明采用的技术方案是：

肝素酶II在解聚肝素前体（Heparosan）制备低分子量肝素（Low Molecular Weight Heparin，LMWH）中的应用。

具体的，所述应用为：以肝素前体为反应底物，加入肝素酶II进行解聚，解聚后的产物再经进一步常规脱乙酰、硫酸化和异构化修饰，制得所述低分子量肝素。虽然肝素前体的多糖骨架与肝素多糖骨架类似，但是未将葡萄糖醛酸异构化为艾杜糖醛酸，也未硫酸化修饰，因此，解聚后的产物需再经进一步脱乙酰、硫酸化和异构化修饰，才能获得本发明低分子量肝素。脱乙酰方法指利用氢氧化钠脱去N-乙酰葡萄糖胺的乙酰基；硫酸化指通过与三甲基铵三氧化硫共聚物和碳酸钠反应在脱乙酰位硫酸化；所述异构化，是指利用C5-异构酶将D-GlcA异构化为L-IdoA。

优选的，所述解聚在25℃下进行，反应时间1.5h。

优选的，所述解聚在缓冲液中进行，缓冲液组成如下：乙酸钠100 mM，BSA 0.01%，乙酸钙10 mM，溶剂为水，pH7.0。

优选的，所述肝素酶II为重组肝素酶II。

本发明还涉及一种利用重组肝素酶II解聚肝素前体制备低分子量肝素的方法，所述方法包括：

（1）根据已报道Flavobacterium heparinum肝素酶II基因序列（Genbank access number U27585.1）和氨基酸序列（Genbank access number AAB18277.1）设计引物，从肝素黄杆菌基因组DNA扩增得到肝素酶II基因片段，克隆到pET-15b表达载体中，获得重组载体pET15b-hepB，pET15b-hepB转化E. coli BL21(DE3)获得重组菌E. coli BL21(DE3) /pET15b-hepB，重组菌经乳糖诱导后，菌液经细胞破碎后提取目标蛋白，获得重组肝素酶II；