[发明专利]肝素酶II在解聚肝素前体制备低分子量肝素中的应用

权利要求书

1.肝素酶II在解聚肝素前体（Heparosan）制备低分子量肝素（Low Molecular Weight Heparin，LMWH）中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述应用为：以肝素前体为反应底物，加入肝素酶II进行解聚，解聚后的产物再经进一步脱乙酰、硫酸化和异构化修饰，制得所述低分子量肝素。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述解聚在25℃下进行，反应时间1.5h。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述解聚在缓冲液中进行，缓冲液组成如下：乙酸钠100 mM，BSA 0.01%，乙酸钙10 mM，溶剂为水，pH7.0。

5.如权利要求1~4之一所述的应用，其特征在于所述肝素酶II为重组肝素酶II。

6.一种利用重组肝素酶II解聚肝素前体制备低分子量肝素的方法，所述方法包括：

（1）从肝素黄杆菌基因组DNA扩增得到肝素酶II基因片段，克隆到pET-15b表达载体中，获得重组载体pET15b-hepB，pET15b-hepB转化E. coli BL21(DE3)获得重组菌E. coli BL21(DE3) /pET15b-hepB，重组菌经乳糖诱导后，菌液经细胞破碎后提取目标蛋白，获得重组肝素酶II；

（2）Heparosan与重组肝素酶II在缓冲液中于25℃下反应1.5h，反应液经分离纯化，得到解聚后的Heparosan；所述缓冲液组成为：乙酸钠100 mM，BSA 0.01%，乙酸钙10 mM，溶剂为水，pH7.0；缓冲液中Heparosan初始浓度为0.01~0.1g/mL，重组肝素酶II初始添加量为100~500U/mL；

（3）解聚后的Heparosan进一步进行脱乙酰、硫酸化和异构化，制得所述低分子量肝素。