[发明专利]基于荧光寿命差分的超分辨显微方法和装置

说明书

技术领域

本发明涉及显微成像领域，尤其涉及一种基于荧光寿命差分的超分辨显微方法及装置。

背景技术

与绝大部分光学成像一样，自从显微镜被发明以来，阿贝衍射极限也一直制约着显微系统分辨率的提高。早期的显微系统均为宽场成像系统，成像分辨能力有限。这一情况直到共聚焦显微系统(Confocal Microscope)发明后才得到一定的改善。共聚焦显微的基本概念在1957年由M.Minsky等人提出(参见M.Minsky等Microscopy Apparatus，美国专利3013467)，但直到1978年该技术才真正得以仪器化(参见C.Cremer等Considerationson a laser-scanning-microscope with high resolution and depth of field，MicroscopiaActa 81，31-44(1978))。与传统的宽场显微系统相比，共聚焦显微系统采用扫描成像的方式，在与成像物面共轭的焦平面上放置一个针孔(Pinhole)对非成像点周围的杂散光进行遮挡，从而有效地限制了系统的有效点扩散函数。通过系统的光学传递函数分析可以证明，使用共聚焦方法，能够在系统的极限分辨率提高约1.4倍。

近年来，随着受激发射损耗显微技术(Stimulated Emission Depletion(STED)microscopy)的提出(参见S.W.Hell等Breaking the DiffractionResolution Limit by Stimulated-Emission-Stimulated-Emission-DepletionFluorescence Microscopy，Optics Letters 19，780-782(1994))，远场光学显微成像的分辨率得到更大的改进，其分辨率被进一步推进达到纳米量级，可以在活细胞上看到纳米尺度的蛋白质，从而从物理上打破了衍射光学极限。其具体原理是：基于传统共焦显微技术，对荧光标记进行荧光激发，与此同时用另一束高强度同轴激光光束形成空心聚焦暗斑，对荧光标记周围的衍射弥散发光进行抑制，这样只有中心点的荧光激发现象可以被观察到，从而打破衍射极限，达到超分辨显微成像的目的。

虽然STED显微技术有效地提高了光学荧光显微系统的成像分辨能力，但是由于其理论本身的限制，要求抑制光束的输入光功率很高(通常达到W量级)，加大了荧光漂白和光毒作用的风险，容易对荧光样品造成不可逆的损害，误导观察现象。为了降低抑制光束的光功率，Vicidomini等人在2011年提出了基于时间门技术的STED显微术(time-gated STED，g-STED)(参见G.Vicidomini等Sharper low-power STED nanoscopy by timegating，Nature Methods 8，571-573(2011))。该技术利用抑制光束照射荧光样品在抑制其受激荧光幅射的同时会缩短其荧光寿命的特点，在系统中设置时间门对荧光信号进行实时过滤，从而有效地将所需要的抑制光束输入光功率降低到数十mW量级。但是，该种方法减少了可有效利用的荧光信号强度，降低了系统信噪比，容易对系统的实际分辨能力产生不利影响。

发明内容

本发明提供了一种基于荧光寿命差分的超分辨显微方法和装置，在保证低抑制光束输入光功率的同时，提高系统的信噪比，从而提高系统的实际分辨能力。

一种基于荧光寿命差分的超分辨显微方法，包括以下步骤：

1)将圆偏振光作为激发光束，使用经涡旋位相编码的圆偏振光作为抑制光束，所述激发光束通过大数值孔径显微物镜聚焦形成实心聚焦光斑，所述抑制光束通过所述大数值孔径显微物镜聚焦形成空心聚焦光斑，两光斑同时对荧光样品进行扫描；

2)利用所述大数值孔径显微物镜收集扫描荧光样品发出的荧光，并通过光电感应器件得到整幅荧光强度图像；

3)通过分析所述荧光强度图像的荧光强度信息，得到相应的荧光寿命信息；

4)设置时间门，对所述荧光寿命信息中的长寿命荧光图像和短寿命荧光图像进行分离；

5)设置权值，用所述的短寿命荧光图像减去加权的长寿命荧光图像，得到最终的超分辨显微图像。

步骤1)中所述的涡旋位相编码是指对于一个横截面中心对称的圆形入射光束，以光束中心点为圆心，对横截面内的光束产生0～2π的涡旋位相延迟，位相延迟量仅与截面内特定点的角向大小有关，而与该点到圆心的距离无关。可用如下公式加以表示：

其中Δα为位相延迟量，为角向大小。