[发明专利]基于荧光寿命差分的超分辨显微方法和装置

权利要求书

1.一种基于荧光寿命差分的超分辨显微方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将圆偏振光作为激发光束，使用经涡旋位相编码的圆偏振光作为抑制光束，所述激发光束通过大数值孔径显微物镜聚焦形成实心聚焦光斑，所述抑制光束通过所述大数值孔径显微物镜聚焦形成空心聚焦光斑，两光斑同时对荧光样品进行扫描；

2)利用所述大数值孔径显微物镜收集扫描荧光样品发出的荧光，并通过光电感应器件得到整幅荧光强度图像；

3)通过分析所述荧光强度图像的荧光强度信息，得到相应的荧光寿命信息；

4)设置时间门，对所述荧光寿命信息中的长寿命荧光图像和短寿命荧光图像进行分离；

5)设置权值，用所述的短寿命荧光图像减去加权的长寿命荧光图像，得到最终的超分辨显微图像。

2.如权利要求1所述的基于荧光寿命差分的超分辨显微方法，其特征在于，所述激发光束的波长应位于所述荧光样品上的荧光标记的荧光吸收光谱带内，所述抑制光束的波长应位于所述荧光样品上的荧光标记的荧光发射光谱带内，且所述抑制光束的波长应长于荧光发射峰值波长。

3.如权利要求2所述的基于荧光寿命差分的超分辨显微方法，其特征在于，对所述荧光强度信息通过时间相关单光子记数算法得到所述的荧光寿命信息。

4.如权利要求3所述的基于荧光寿命差分的超分辨显微方法，其特征在于，所述权值设置为0～1。

5.如权利要求4所述的基于荧光寿命差分的超分辨显微方法，其特征在于，所述权值为0.5。

6.一种基于荧光寿命差分的超分辨显微装置，其特征在于，包括：

沿激发光束光路依次布置的第一激光器、位相编码器和第一偏振态转换器；

沿抑制光束光路依次布置的第二激光器和第二偏振态转换器；

用于对所述激发光束和抑制光束进行聚焦，并收集荧光样品发出的荧光信号的大数值孔径显微物镜；

用于扫描荧光样品的扫描器；

用于感应所述荧光强度的光电感应器件；

以及用于信号分析处理的计算机。

7.如权利要求6所述的基于荧光寿命差分的超分辨显微装置，其特征在于，所述第一偏振态转换器和第二偏振态转换器均由二分之一玻片和四分之一玻片组合而成。

8.如权利要求7所述的基于荧光寿命差分的超分辨显微装置，其特征在于，所述位相编码器为位相板。

9.如权利要求8所述的基于荧光寿命差分的超分辨显微装置，其特征在于，所述扫描器为二维扫描移动平台或二维扫描振镜。

10.如权利要求9所述的基于荧光寿命差分的超分辨显微装置，其特征在于，所述超分辨显微装置还包括用于对所述大数值孔径显微物镜收集的荧光信号进行聚焦的凸透镜，以及位于所述凸透镜的焦平面上，用于遮挡理想焦点外荧光散射噪声的针孔。