[发明专利]富集重镉的基因工程菌及其构建和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及镉富集基因工程菌及其构建方法和应用，具体是指镉富集基因工程菌构建及其构建得到的一株菌株，还涉及该菌株的镉耐受和镉吸收等功能的表征。

背景技术

由工农业生产活动产生的大量重金属对人类和生态环境造成了非常严峻的危害, 例如Cd、Hg、As、Pb等，可以代替Zn、Fe、Cu以及其它的一些非重金属元素，破坏它们作为一些蛋白和酶的辅因子作用，从而干扰生物体的正常生理代谢活动。而且大部分重金属可以长期停留在环境土壤中，用传统的物理化学方法修复，包括利用化学试剂提取、电化学、就地掩埋等等，往往代价过高、效率低下，甚至会改变土壤的物理和化学结构，大大降低土壤肥力。

近年来，以基因工程菌为基础的生物修复方式以其经济性和有效性等优势，正得到越来越多的重视。恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）是具有很强抗逆性能的一株环境优势菌株，能够降解环境中的多种有机污染物，如甲苯，并具有一定的重金属（如Cu和Cd）耐受能力等。恶臭假单胞菌KT2440(Pseudomonas putida KT2440) 是一株模式环境微生物菌株，也是迄今遗传研究阐述得最为清晰、代谢多样性研究得最为透彻的腐生假单胞菌，且作为根际促生菌，可以与植物配合作用，增强植物在环境胁迫尤其是重金属污染中的生存能力。恶臭假单胞菌KT2440基因组在2002年被解析，是第一个被解析的恶臭假单胞菌菌株。由于其遗传操作系统简单清晰，是首选的基因克隆、表达的革兰氏阴性菌株之一。

目前利用微生物修复治理土壤中的重金属污染土壤的机理包括通过菌体分泌的有机酸和氨基酸的溶解作用、微生物对重金属的生物转化作用等。而来源于裂殖酵母、低等藻类和大部分植物的植物螯合肽合成酶，在重金属离子的诱导下，可以催化低分子量的谷胱甘肽（GSH）并通过转肽反应生成相对高分子量的植物螯合肽（γ-Glu-Cys）n-Gly（n=2-11），后者是具有更强金属螯合能力的非蛋白巯基（NPT）多肽。研究表明，通过在E.coli中异源表达粟酒裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）SpPCS基因和小麦AtPCS基因可以明显增强工程菌的耐Cd能力，并可以提高菌体中Cd的累积量（分别达到14.9 μmol/g[dry weight] 和7.2 μmol/g[dry weight]）。

发明内容

本发明的第一个技术目的在于提供了一株新的可以富集重金属镉的恶臭假单胞菌基因工程菌；使得本发明得到的基因工程菌株具有可以作为植物促生菌，可与植物配合协同修复重金属污染土壤的潜力。

本发明的第二个技术目的在于提供上述基因工程菌株的构建方法，该构建方法是一种在恶臭假单胞菌KT2440中异源表达粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）植物螯合肽合成酶基因SpPCS 的基因工程方法。

本发明的第三个技术目的在于上述基因工程菌株在配合植物协同修复土壤重金属污染中的应用。

为实现本发明的技术目的，本发明采用以下技术方案。

一、采用本发明所述的构建方法得到的一株富集重镉的基因工程菌，其分类命名为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）KT2440-SpPCS，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2012435。

二、本发明所述的可恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）KT2440-SpPCS的构建方法：以环境模式菌株恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）KT2440为出发菌，重组表达粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）基因SpPCS，获得可以富集重金属镉的目标基因工程菌。

具体步骤如下：

1）以粟酒裂殖酵母基因组DNA为模板，PCR扩增出SpPCS基因，经T-A克隆连接到测序载体PMD19-T Simple质粒，挑正确的转化子，经测序，比对正确，得到包含表达基因SpPCS的中间质粒PMD19-T-SpPCS； 

2）设计酶切位点将SpPCS插入到表达质粒pBBR1MCS-5载体的相应的酶切位点之间、连接获得重组质粒pBBR1MCS-5-SpPCS；