[发明专利]一种白血病单链抗体库及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属基因工程，涉及一种全人源白血病单链抗体库和其构建方法，及其在制备白血病抗体药物中的应用。

背景技术

自和Milstein创立淋巴细胞杂交瘤技术至今，单克隆抗体在肿瘤的诊断和治疗领域得到了广泛的应用。第一代应用于人类疾病治疗的主要是鼠源性单抗，但是鼠单抗的主要缺点是引起人体免疫反应，人体产生的人抗鼠抗体使其很快清除，不能很好的发挥其生物学功能，因此在临床应用中受到限制；第二代抗体是在鼠单抗基础上，通过基因重组形成了嵌合式抗体和人源化抗体，但两者应用于人体依旧存在免疫原性问题；目前，人们正致力于第三代抗体即全人源性单克隆抗体的研究，主要采用噬菌体展示技术（phage display）结合基因工程技术，由此产生的多株人源性单克隆抗体已经成功地应用于临床疾病的治疗。特别是在肿瘤治疗领域，迄今为止，美国FDA已经批准了12种单克隆抗体药物上市，成为全球生物制药领域的热点。

噬菌体展示技术最初由Smith于1985年创建，噬菌体作为一种表达载体将多肽展示于病毒外壳。基本原理是将外源DNA插入到丝状噬菌体的基因组DNA中，使外源DNA编码的肽段得以表达并伸展到噬菌体表面。通过采用与固定配体相互作用的亲和筛选方法，可以富集得到能表达某种特异肽序列的噬菌体。噬菌体（phage）和噬菌粒（phagemid）都可作为表达载体来展示抗体或其他蛋白。噬菌粒携带表达gⅢ外壳的基因、克隆位点及噬菌体包装信号，并由辅助噬菌体（如M13KO7或VCS-M13）提供完成包装所需的结构蛋白。含有完整噬菌体基因组的丝状噬菌体常用来构建肽库，而噬菌粒能够展示大量重组蛋白，更易于产生可溶性蛋白，同时自身不易受异源基因影响，因此在噬菌体抗体库构建中占据主导地位。

抗体片段是首次在噬菌体表面成功展示的蛋白质。1990年，McCafferty等采用PCR方法扩增出完整的抗体可变区基因，将多样性可变区基因组装到表达载体内，转化宿主细胞，并最终表达到噬菌体表面，从而得到多样性噬菌体抗体集合，即噬菌体抗体库。噬菌体展示抗体技术可以制备全人源的抗体，是将抗体基因克隆到丝状噬菌体的基因组DNA中，与噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白，从而使异源分子展示于噬菌体表面。主要特点是将特定的分子的基因型和表达型同时出现在一个噬菌体颗粒内，通过DNA测序可以获得特定展示抗体片段的基因序列信息，并可用特定的靶抗原筛选出特异性的噬菌体抗体；在此基础上，可以通过基因工程的方法，在大肠杆菌表达可以得到大量表达的抗体。

噬菌体抗体库技术模拟了人类B细胞的分化成熟过程，首先通过分子生物学手段将人类抗体的重链和轻链等功能基因连接起来，插入噬菌体载体上，使其展示在噬菌体表面。目前，最受关注的噬菌体展示的抗体分子，主要包括抗体结合片段(fragment antigen binding,Fab)、单链抗体(single-chain variable fragment,scFv)等。相对于完整的抗体分子，Fab和scFv等小分子片段结构简单（不存在Fc段），组织穿透率高，并且能够在原核生物中高效表达。其中scFv是目前报导最多的一种小分子抗体，是由抗体识别抗原的可变区Fv段组成。scFv由重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）通过连接区（linker）连接而成。所加的linker很重要，必须不影响scFv的构象。将scFv基因克隆在丝状噬菌体载体pIII基因先导序列和pIII基因之间，以融合蛋白的形式被导入细菌膜间隙，并组装成scFv，在加入辅助噬菌体M13K07后，scFv以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面。pCANTAB-5E载体的特点是，在scFv基因后面含有一段编码Tag尾肽(E-Tag)的序列，在E-Tag后面有一个琥珀(Amber)终止密码，位于scFv基因与pIII基因之间，在抑制性细菌TG1中，这种琥珀密码子只有20%有效，所以在蛋白翻译过程中可以被通读而形成scFv-pIII融合蛋白；而在非抑制性菌株中，如HB2151，此终止子被识别，同时scFv基因在pIII基因前终止，形成独立的抗体蛋白，滞留于细胞膜间隙，并在长时间培养后释放于培养液中，形成可溶性表达。再用特定的肿瘤相关抗原，通过“吸附-洗脱-扩增”的淘筛过程（panning），可筛选出特异性单链抗体。

发明内容