[发明专利]一种白血病单链抗体库及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种白血病单链抗体库，其特征在于：该抗体库含有全套人类抗体重链可变区VH和轻链可变区VL，及中间连接区linker序列为(GGGGS)₃，有完整的抗原结合部位，以噬菌粒pCANTAB-5E为载体，库容达到1.5×10⁹。

2.根据权利要求1所述的一种白血病单链抗体库的构建方法，其特征在于通过以下步骤实现：

（1）总RNA提取和cDNA的合成：取白血病患者的血液，分离淋巴细胞，用裂解液裂解淋巴细胞，提取细胞总RNA，经逆转录PCR逆转录为cDNA；

（2）用PCR方法扩增抗体重链和轻链可变区基因：根据人类抗体基因序列，分别设计PCR扩增抗体重链、轻链可变区所需的特定引物，共32条，序列如SEQ ID NO.1-32所示；以步骤（1）获得的cDNA为模板，用PCR方法扩增可变区基因VH和VL，包括Vκ和Vλ；

（3）单链抗体scFv基因片段的组装和全长扩增：设计含有由四个甘氨酸和一个丝氨酸组成的重复3次的连接肽序列和酶切位点SfiI、NotI 的引物，在上述扩增的重链VH和轻链VL可变区基因的基础上，再经重叠PCR获得scFv基因；

（4）重组噬菌粒的构建：分别用SfiI、NotI双酶切scFv基因片段，将其插入噬菌粒载体pCANTAB-5E，构建重组噬菌粒，转化感受态E. coli TGl，经辅助噬菌体M13K07超感染，获得单次的噬菌体抗体库，经重复转化后，获得全人源白血病单链抗体库，库容达到1.5×10⁹；

（5）单链抗体库的多样性分析：随机挑取多个单克隆菌，测定插入区scFv基因的DNA序列，经ClustaIW序列比对软件分析其序列的相似性，判断单链抗体库的多样性分析，证明其多样性良好。

3.根据权利要求2所述的一种白血病单链抗体库的构建方法，其特征在于：步骤（3）所述连接肽序列和酶切位点SfiI、NotI 的引物序列如SEQ ID NO.33-64所示。

4.根据权利要求1所述的一种白血病单链抗体库在制备白血病抗体药物中的应用，其特征在于通过以下步骤实现：用白血病相关抗原作为靶抗原，用噬菌体展示的方法，筛选全人源白血病单链抗体库，经过四轮“吸附-洗脱-扩增”的淘筛过程，筛选出抗白血病的特异性单链抗体，制备白血病抗体药物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述白血病相关抗原选用CD33胞外区蛋白。