[发明专利]高效克隆筛选表达载体、其制备方法及用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物学领域，特别是涉及一种用piggyBac转座系统的ITRs序列构建的高效克隆筛选表达载体，该载体的构建方法及其用途。

背景技术

转座子是基因组中一段可移动的DNA序列，可以通过切割、重新整合等一系列过程从基因组的一个位置“跳跃”到另一个位置。转座子占人和小鼠基因组序列的40％以上（Nature,2001,409,860–921；Nature,2002,420,520–562）。

自从McClintock从玉米中发现第一个转座子以来（Proc.Natl.Acad.Sci.1950,USA36,344–345），转座因子已成为很多生物宝贵的遗传分析工具。在原核生物中，利用转座子进行的突变研究发现了在有害微生物致病时起重要作用的基因（Science,1999,286,2165–2169；J.Virol.2003,77,123–134）。在真核生物中，运用P因子（一种转座子）的转基因和插入突变技术大大推动了果蝇遗传学的发展。包括P因子在内的许多转座子在其天然宿主以外的生物体中没有活性，说明转座过程涉及一些宿主因子（Arch.Insect Biochem.Physiol.1993,22,373–384）。Tc1/Mariner家族在内的几种转座系统已应用于小鼠和斑马鱼。一种利用比较系统发育学手段人工合成的Tc1类转座子Sleeping Beauty(SB)被证明在小鼠和人的细胞中具有活性（Cell 1997,91,501-510；Proc.Natl.Acad.Sci.1998,USA 95,10769–10773）。虽然SB和Minos等转座子已在小鼠体内进行了插入突变测试，但由于新插入位点集中在原始位点周围、转座效率低下以及携带DNA长度有限等原因，这些转座子并没有被广泛地应用（Genomics 2003,81,108-111；Mol.Cell.Biol.2003,23,9189-9207）。

PB因子是一种来源于飞蛾甘蓝尺蠖中的DNA转座子，全长2472个碱基。它两端含有13个碱基的反向末端重复序列(ITR)，并编码一个594个氨基酸的转座酶。PB已被成功地用于黑腹果蝇和其它昆虫的遗传分析。它特异地插入四碱基TTAA位点，并在插入位点两侧形成TTAA重复（Virology 1989,172,156–169；Virology 1995,211,397–407；Insect Mol.Biol.1996,5,141–151）。由于其特有的转座酶和TTAA目标序列，PB成为了一个新的DNA转座子家族——piggyBac家族的代表（In Mobile DNA II,2002,pp.1093–1110）。PB作为生殖系转基因工具已被应用于四个目的十余种昆虫（Insect Biochem.Mol.Biol.2003,33,449–458）。作为诱变剂，PB在黑腹果蝇中的转座效率至少和P因子相当（Nat.Genet.2004,36,283–287）。在红色面象虫Tribolium castaneum中，PB在非同源染色体间也可高效转座（Insect Mol.Biol.2003,12,433–440）。霉菌到哺乳动物等许多系统发育地位不同的物种基因组中都发现有很多类似PB的序列，进一步预示了PB的活性可能并不仅局限在昆虫中（Mol.Genet.Genomics,2003,270,173–180）。事实上，最近发现PB也能在涡虫Girardiatigrina、哺乳动物及其细胞中具有高效的转座活性，已在动物基因组功能研究、基因转移及诱导多能干细胞等领域得到了广泛应用（Proc.Natl.Acad.Sci.2003,USA 100,14046–14051）。

虽然PB系统具有广泛的宿主性，以及高效的转染效率，而且在哺乳动物细胞中已广泛用于基因治疗（Molecular Therapy,2007,15,139-145），但是目前其在体外研究还未曾有相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种高效克隆筛选表达载体，它可以大大提高转染效率和阳性克隆的筛选率。

为解决上述技术问题，本发明的高效克隆筛选表达载体，由piggyBac转座系统的ITRs序列插入到哺乳动物表达载体中得到。

本发明要解决的技术问题之二是提供上述高效克隆筛选表达载体的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明的高效克隆筛选表达载体的制备方法，包括以下步骤：