[发明专利]双峰驼乳铁蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，是一种双峰驼乳铁蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法。

背景技术

乳铁蛋白(lactoferrin，LF)是一种非血红素铁结合性糖蛋白，属于转铁蛋白家族。广泛分布于人和哺乳动物家畜的多种组织及外分泌液中。研究发现，LF是一种具有多种生物学功能的蛋白质，它不仅参与铁的转运，而且发现乳铁蛋白有着更为广泛的生物学功能，其中主要包括广谱抗菌、抗病毒，调节体内铁平衡，促进骨髓细胞生成，促进细胞生长，增强机体免疫抗病能力，抑制肿瘤细胞，能与多种抗生素及抗真菌制剂协同作用，更有效治疗疾病，参与某些炎症反应和对机体免疫系统产生调节作用，是机体免疫防御系统中的一种重要成分。

乳铁蛋白的研究，国外是从20世纪80年代开始，而国内近几年才真正开始。在结构研究方面，1982年，G.Spik等研究确定了乳铁蛋白一级结构，在1984年，M.H.Metz-Boutigue等对人乳铁蛋白的氨基酸序列进行了研究。1992年，Bellamy等发现了乳铁蛋白分子抗菌活性中心，并命名为乳铁素（lactoferricin, LFcin）。1997年D.A.Dionysius等发现该活性中心是由25个氨基酸组成，分子量为3195。1997年，S.A.Moore等研究揭示乳铁蛋白的三维空间结构。

在研究乳铁蛋白的生物学特性和功能方面，在1939年人们发现乳铁蛋白以来就一直进行深入研究。1975年，Porath等发现乳铁蛋白能吸附重金属离子；1993年Nagasaka等也报道牛乳铁蛋白能稳定还原态的铁离子，而其它乳清蛋白无此功能。此外，乳铁蛋白还能促进肠黏膜细胞的增殖，调节肠黏膜中巨噬细胞的吞噬功能；调节骨髓细胞的生成和机体黏膜免疫功能、调整机体补体系统活性和炎症反应、刺激溶菌酶再生等一系列生物活性。

 Stefan Kapprler(1998)对单峰驼乳中乳铁蛋白进行了系统的研究，结果表明，母驼分娩后第二天的乳样中乳铁蛋白的含量为5.10g/L,而牛乳中为0.50g/ L；分娩后30d时骆驼乳中乳铁蛋白的含量下降到0.34g/L,此时牛乳中乳铁蛋白的含量下降到0.06g/L。

Elagamy(2000)研究表明，骆驼乳中乳铁蛋白的含量显著高于牛乳和水牛乳中的含量，其含量分别是牛乳和水牛乳的2倍和6倍。Duhaiman(1998)和Elagamy（2000）分别报道了骆驼乳中乳铁蛋白的分子质量分别为78ku和79.5ku。Zhang等（2005）研究报道，内蒙古阿拉善双峰驼乳中乳铁蛋白的分子质量为80ku；而牛乳中乳铁蛋白的分子质量为76.9ku。Elagamy(2000)研究报道，牛乳中乳铁蛋白的分子量为76ku，进一步研究表明骆驼乳中乳铁蛋白的活性较牛乳和水牛乳具有较强的耐热性。

内蒙古阿拉善盟的双峰驼驼乳中的乳铁蛋白含量明显比牛乳中的乳铁蛋白含量高，且乳铁蛋白具有十分重要的生物学功能，但是，国内外目前对于双峰驼乳铁蛋白的研究甚少。所以研究驼乳中的乳铁蛋白具有非常重要的意义。

发明内容

本发明提供了一种双峰驼乳铁蛋白基因，该基因是一种控制转铁蛋白家族的非血红素铁结合性糖蛋白合成相关的基因密切相关的基因，其核苷酸序列与单峰驼乳铁蛋白核酸序列AJ131674.1具有90%的相似性。

本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种双峰驼乳铁蛋白基因，该基因是一种控制转铁蛋白家族的非血红素铁结合性糖蛋白合成密切相关的基因，具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第22-2104位的核苷酸序列，其核苷酸序列与单峰驼乳铁蛋白核苷酸序列AJ131674.1具有90%的相似性。

本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种双峰驼乳铁蛋白基因的重组蛋白。

下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进：

上述重组蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

上述重组蛋白为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

上述重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

上述重组蛋白通过设计一对引物从双峰驼乳铁蛋白中得到双峰驼乳铁蛋白基因，该引物对的核苷酸序列正向引物为SEQ ID NO.3和反向引物为SEQ ID NO.4，其序列信息如下：

SEQ ID NO.3：5’- ATGAAGCTCTTCTTCCCCGCC -3’，

SEQ ID NO.4：Oligo dT。