[发明专利]壳聚糖在卵黄脂肪沉淀脱脂技术中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及壳聚糖在卵黄脂肪脱脂技术中的应用。

背景技术

禽卵黄抗体是禽类B淋巴细胞在抗原物质刺激下所产生并沉积在卵黄中的一种蛋白质，主要成分为免疫球蛋白IgY（Immunoglobulin of yolk)，由禽类血清免疫球蛋白转移而来，功能上相当于哺乳动物IgG（Immunoglobulin G），结构上具有典型的免疫球蛋白空间构象，但不含绞链区。与哺乳动物免疫球蛋白IgG相比，禽类卵黄抗体具有很多优越性：其一，由于禽类与哺乳动物种系发生学的距离，禽类免疫球蛋白IgY不会激活哺乳动物的补体系统，不与哺乳动物免疫球蛋白IgG细胞表面Fc受体结合，更适合于生产用于检测哺乳动物抗原的特异性抗体，在免疫检测与诊断中具有重要意义；其二，禽类免疫球蛋白IgY具有较高的稳定性，耐酸，耐碱，耐热，耐冷藏，抗反复冻融，抗胃蛋白酶降解，方便生产、加工、储存和运输，还可用于幼龄动物的经口给服；其三，卵黄中抗体浓度能长期维持或超过血清中抗体浓度，产量高，成本低，便于规模化生产；其四，从禽类卵黄中制备抗体可免去动物采血，符合现代动物保护规则，降低劳动成本；其五，产生有效免疫反应所需抗原量少，尤其是对高度保守的哺乳动物蛋白质。

作为一种高产优质的多克隆抗体，卵黄抗体IgY具有十分广泛的用途和良好的开发应用前景，可以应用于人类和畜禽多种疾病的临床治疗、诊断和预防，可以作为免疫检测工具应用于生物科学研究，可以用作饲料添加剂、保健品和无公害防腐剂等等。近年来，用卵黄生产制备多克隆抗体的技术已逐渐兴起。除水分外，卵黄中的主要成分是蛋白质和脂肪，其比例约为1：2，其中大部分蛋白为脂蛋白，不溶于水，虽然免疫球蛋白IgY是水溶的，但在卵黄中它与脂类、磷蛋白等形成稳定的乳化状态。所以，提取卵黄抗体IgY首先必须将卵黄中脂类组分和水溶性组分（蛋白）进行分离，即进行卵黄脱脂处理。IgY的分离纯化曾一度成为难题，主要困难就在于如何去除高浓度的脂类。

自从20世纪60年代Williams发现卵黄中存在大量的抗体以来，用于提取卵黄抗体的卵黄脱脂技术就得到了关注。1980年Polson等（Immunol Commun(Invest),1980,9(5):475-493）首先提出聚乙二醇沉淀法，1990年又改良为氯仿沉淀法（Immunol Invest,1990,19(3):253-258）。1981年Jensenius等（Journal of Immunological Methods,1981,46:63-68）提出硫酸葡聚糖沉淀法。1984年Bade和Stegemann（J Immunol Methods,1984,72(2):421-426）用预冷的异丙醇和丙酮沉淀蛋白并去除脂类。1988年Hatta等（J Food Sci,1988,53(2):425-427）用海藻酸钠分离卵黄脂蛋白和水溶性组分，1990年又通过比较几种天然树胶的脱脂效果提出κ-角叉藻聚糖法和黄原胶法，κ-角叉藻聚糖脱脂效果较好但免疫球蛋白产量不如黄原胶（Agric Biol Chem,1990,54(10):2531-2535）。1992年Akita等（J.Food Sci.,1992,(57):629-634）最早采用水稀释法，并于1993年比较了水稀释法、聚乙二醇法、硫酸葡聚糖法和黄原胶法的提纯效果，结果表明：水稀释法产量最高，依次为硫酸葡聚糖法、黄原胶法和聚乙二醇法（J Immunol Methods,1993,160(2):207-214）。但水稀释法用水量较大（10倍稀释）且操作繁琐。1993年Horikoshi等（Journal of Food Science.1993,58(4):739742）报道了冷乙醇法，但免疫球蛋白得率仅40%，且耗能高。1994年McLaren等（J Immunol Methods,1994,177:175-184）提出了辛酸法。2000年Deigan（Food and Agricultural Immunology,2000,12:77-85）在比较了5种脱脂方法后，提出了他认为简单而经济的反复冻融法，但其产率低于硫酸葡聚糖法近20%；同年，Bizhanov等（Vet Res Commun,2000,24(2):103-113）采用蓝色葡聚糖法获得与聚乙二醇法相当的产率。2004年徐锡殿等（山东家禽,2004,2:10-11）报道了泊洛沙姆对鸡卵黄的脱脂作用。2009年邓碧华（动物医学进展,2009,30(1):38-40）比较了泊洛沙姆和聚乙二醇的脂脱效果，认为二者没有明显区别，当浓度过高时都破坏抗体蛋白的水化膜从而影响抗体效价，且泊洛沙姆成本高于聚乙二醇。2011年张伦等（中国动物检疫,2011,28(3):49-51）进行了泊洛沙姆—辛酸法对鸡卵黄脱脂条件的研究，发现随辛酸浓度加大蛋白回收率和抗体效价都逐渐降低。2012年吴博等（中国兽药杂志,2012,46(6):42-45）比较了五种提取卵黄抗体的方法，回收率从高到低依次为辛酸法、酚沉淀法、水稀释法、乙酸－乙酸钠法和海藻酸钠法，但所得卵黄抗体效价从高到低依次为辛酸法、海藻酸钠法、水稀释法、酚沉淀法和乙酸－乙酸钠法。1995年，公开号为CN1117974A的中国专利公开了一种提取卵黄中抗体的新方法-甲醛脱脂法；1998年，公开号为CN1202496A的中国专利公开了一种利用苯酚使卵黄溶液破乳的苯酚脱脂法。但上述方法存在以下问题：使用大量无机或有机试剂，甚至有毒有机溶剂，有毒有害试剂的残留很难去除；脱脂的同时也消耗蛋白，IgY损失率高，甚至会导致抗体失活；需要使用大量仪器设备，增加了脱脂成本。于是，脱脂剂无毒、无害且仪器设备使用量少以减少脱脂成本等成为卵黄脱脂技术追求的目标。公开号为CN101225103A的中国专利公开了卵黄聚乙二醇一次沉淀脱脂技术，安全、无毒，不使用大型仪器设备，但该方法使用的脱脂剂为聚乙二醇，利用的是聚乙二醇的强吸水能力打破卵黄的乳化状态，脱脂试剂使用量较大，IgY损失率较高。