[发明专利]一种嘌呤核苷磷酸化酶基因敲除的大肠杆菌Ecoli-SL26的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种嘌呤核苷磷酸化酶基因敲除的大肠杆菌Ecoli-SL26的构建方法。

背景技术

核苷酸作为重要的食品添加剂和药物中间体而被业界广泛关注并研发，其中5`-肌苷酸钠(5`-IMP) 和5`-鸟苷酸钠(5`-GMP)具有浓烈的鲜味，是新一代鸡精调味品的主要原料，而3`-肌苷酸钠和2`-肌苷酸钠鲜味则基本没有鲜味(周秀芹，2010)。当前，以肌苷和鸟苷为原料加上合适磷酸供体，采用化学法和酶法催化都可以获得5`-肌苷酸和5`-鸟苷酸，然而由于酶法具有催化条件温和、专一性较强、对环境友好、特异性高等特点(Asano和MIhara等,1999;崔桂友，2003；宋勇波和储炬等，2003；Kuninaka, 1960 )，而受到国内外科研人员和产业界的广泛关注，发展迅速。其中，日本味之素公司已采用酶催化技术生产呈味核苷酸，韩国希杰则利用发酵直接产肌苷酸和鸟苷酸。希望能够充分利用酸性磷酸酶这一催化特性(ZHANG Chong和XING Xinhui等，2005)，以期开发出高效生产呈味核苷酸的酶工程技术。

酸性磷酸化酶在大肠杆菌表达之后，催化过程会表现出一定程度降解肌苷成次黄嘌呤，影响了肌苷的转化率，对后续的提取过程中肌苷的套用增加了难度。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种嘌呤核苷磷酸化酶基因敲除的大肠杆菌Ecoli-SL26的构建方法，用于阻断肌苷转变为次黄嘌呤。

嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)是嘌呤补救合成途径的关键酶之一，广泛存在于原核和真核生物中(Bzowska和Kulikowska等，2000 )。该是一种戊糖基转移酶，催化嘌呤核苷与正磷酸作用生成自由嘌呤及核糖-5-磷酸的反应。

为了实现上述目的，本发明提供一种嘌呤核苷磷酸化酶基因敲除的大肠杆菌Ecoli-SL26的构建方法，为敲除其嘌呤核苷磷酸化酶基因（purine nucleoside phosphorylase，简称PNP），本发明利用Red/ET系统同源重组，在四环素（Tet）和卡那霉素（Kam）双重抗性下筛选嘌呤核苷磷酸化酶基因成功敲除的大肠杆菌Ecoli-SL26，沉默肌苷水解为次黄嘌呤的途径，提高磷酸转移酶的转化率。

一种嘌呤核苷磷酸化酶基因敲除的大肠杆菌Ecoli-SL26的构建方法，包括如下步骤：

（1）通过NCBI查找大肠杆菌PNP基因，设计引物PCR扩增得到同源重组缺失的嘌呤磷酸化酶基因，以验证宿主中PNP的存在；

所述引物为：PNP-upper: 5’-TTTTGATGCCAGGCGACCCG-3’；

PNP-lower: 5’-CGGATGTGGTCAGATACGGT-3’；

（2）通过NCBI查找大肠杆菌PNP基因及其上下游基因的同源性情况，根据K006-Ecoli-Gene Deletion Kit要求，合成可行的同源臂引物PCR，扩增得到在Red/ET系统同源重组中的功能片段；

所述功能段扩征的引物为：

deoD-FRT-f：

5'-CTGATGGATTTGGGCGGAGCGTTGACTCCGCCTTTGTTATGTCACAAAAAGGATAAAACAAATTAACCCTCACTAAAGGGCG；

deoD-FRT-r：

5'-AAAGCCGGAGCAGTCTCCCGCTCCGGCTTCACAAGGCAATCGCCTTGCAGCGAAACACAATAATACGACTCACTATAGGGCTC；

（3）制备宿主的感受态细胞，电转质粒pRedET，帮助功能片段同源重组：

（4）阿拉伯糖诱导含有pRedET的感受态宿主后，电转化线性的功能片段；

（5）在pRedET质粒的帮助下，功能片段与染色体基因组上的PNP进行同源重组：

（6）电转化表达质粒706-FlP，帮助消除同源整合到染色体上的抗性标记：

（7）通过温度变化，消除抗性标记以及丢失表达质粒706-FlP。

在上述构建方法中，在该方法中用于重组和缺失抗性标记的两个质粒pRedET和706-FLP均为K006-Ecoli-Gene Deletion Kit提供。

在上述构建方法中，步骤（3）是采用Eppendorf-Electroporator2510电转仪，在1350V下进行电转。