[发明专利]一种嘌呤核苷磷酸化酶基因敲除的大肠杆菌Ecoli-SL26的构建方法

权利要求书

1.一种嘌呤核苷磷酸化酶基因敲除的大肠杆菌Ecoli-SL26的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）通过NCBI查找大肠杆菌PNP基因，设计引物PCR扩增得到同源重组缺失的嘌呤磷酸化酶基因，以验证宿主中PNP的存在；

所述引物为：PNP-upper: 5’-TTTTGATGCCAGGCGACCCG-3’；

PNP-lower: 5’-CGGATGTGGTCAGATACGGT-3’；

（2）通过NCBI查找大肠杆菌PNP基因及其上下游基因的同源性情况，根据K006-Ecoli-Gene Deletion Kit要求，合成可行的同源臂引物PCR，扩增得到在Red/ET系统同源重组中的功能片段；

所述功能段扩征的引物为：

deoD-FRT-f：

5'-CTGATGGATTTGGGCGGAGCGTTGACTCCGCCTTTGTTATGTCACAAAAAGGATAAAACAAATTAACCCTCACTAAAGGGCG；

deoD-FRT-r：

5'-AAAGCCGGAGCAGTCTCCCGCTCCGGCTTCACAAGGCAATCGCCTTGCAGCGAAACACAATAATACGACTCACTATAGGGCTC；

（3）制备宿主的感受态细胞，电转质粒pRedET，帮助功能片段同源重组：

（4）阿拉伯糖诱导含有pRedET的感受态宿主后，电转化线性的功能片段；

（5）在pRedET质粒的帮助下，功能片段与染色体基因组上的PNP进行同源重组：

（6）电转化表达质粒706-FlP，帮助消除同源整合到染色体上的抗性标记：

（7）通过温度变化，消除抗性标记以及丢失表达质粒706-FlP。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在该方法中用于重组和缺失抗性标记的两个质粒pRedET和706-FLP均为敲除试剂盒提供。

3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（3）是采用Eppendorf-Electroporator2510电转仪，在1350V下进行电转。

4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，构建过程所用的培养基均为LB，培养温度在30-37℃，pH在6.0-7.0。