[发明专利]甘蔗黑穗病病原菌多克隆抗体的制备

说明书

技术领域

本发明涉及植物抗病性鉴定领域，具体是一种甘蔗黑穗病病原菌多克隆抗体的制备。

背景技术

甘蔗黑穗病是由黑粉菌（Ustilago scitaminea syd）引起的一种真菌性病害，自1877年在南非的纳塔尔地区首次被发现至今在全国的各个植蔗区均有此病发生的报道。此病是一种气传性病害，能够导致蔗茎产量和蔗糖分的严重损失，随着宿根年限的增加发病越来越严重，发病严重的品种和地块发病率达到60%，因此病而淘汰了一批丰产高糖的甘蔗优良品种。防治此病最有效最经济的方法是培育优良的甘蔗新品种，而抗病性的鉴定是抗病育种的基础和关键，鉴定的准确性和效率直接影响到抗病育种的进程和效果。

目前，国内外还主要是通过鉴别寄主法对甘蔗进行抗黑穗病性鉴定，此法周期长，工作量大，耗资高，通常由实生苗育成新甘蔗品种的概率为1/100000，因此此法与甘蔗育种的大群体要求不相适用。随着免疫学技术的发展成熟及其在动植物病原菌检测上的成功应用，使得应用此方法检测甘蔗黑穗病成为可能。该方法具有操作简单，可同时检测多个样品等优点，符合甘蔗育种过程中大群体筛选的需求。但是，目前还未见有甘蔗黑穗病抗体制备的报道。因此，制备甘蔗黑穗病病原菌抗体并结合针刺接种技术，可在甘蔗实生苗期进行批量的筛选，提高筛选效率，缩短甘蔗抗黑穗病育种年限。

发明内容

本发明的目的为了克服已有对甘蔗进行抗黑穗病性鉴定的鉴别寄主法的周期长，工作量大，耗资高，提供一种具有纯度高，特异性好，效价高，保存长久，对甘蔗通过免疫学方法检测甘蔗黑穗病和人工接种提高甘蔗抗黑穗病育种效率的甘蔗黑穗病病原菌多克隆抗体的制备。

本发明通过下述的技术方案来实现：

一种甘蔗黑穗病病原菌多克隆抗体的制备，其特征在于：采集甘蔗大田的甘蔗黑穗病病原菌，制备抗原，将抗原在PDA培养基上培养获得到多克隆抗体，主要包括以下步骤：

（1）抗原采集和制备：在甘蔗大田采集黑穗病病原菌，制备抗原（真菌孢子，菌丝体胞外多糖或上清液）备用；

（2）抗原免疫培养：将获得的抗原与等量的福氏完全佐剂混合，乳化，在颈背部皮下多点注射，免疫新西兰白兔；第15天，取1ml抗原加入等量福氏不完全佐剂，乳化，在颈背部皮下多点注射，免疫新西兰白兔；每隔2周，按照所述的剂量和方法多次免疫白兔，在第八周测定效价达到要求后，颈动脉取血备用；

（3）分离纯化：将步骤（2）获得的抗血清进行分离纯化，获得甘蔗黑穗病病原菌多克隆抗体。

以上所述的抗原采集和制备，主要步骤是：

（1）从甘蔗大田中采集黑穗病鞭子，将白色薄膜去除后，将黑穗病真菌孢子粉收集到牛皮纸袋中，然后于45℃中烘干1h，用保鲜袋包好存于4℃冰箱中备用；

（2）将真菌孢子用无菌水按50-100个孢子/ml稀释，涂布于含有50ng/ml链霉素的PDA固体培养基上，于28℃恒温培养箱中培养3天，获取单菌落后，挑取少许菌丝体到含有50ng/ml链霉素的PDA液体培养基中，于28℃恒温培养箱中培养2天；

（3）上清液抗原的制备：量取适量步骤（2）的培养液，于冷冻离心机中4℃，4000r/min，5min离心，取上层清液作为抗原，放入-20℃冰箱中保存，备用；

（4）菌丝体胞外多糖抗原的制备：量取适量步骤（2）的培养液，于冷冻离心机中4℃，4000r/min，5min离心，吸取上清液，加入2倍体积的95%的乙醇，用灭菌的玻璃棒搅起丝状沉淀物，再于冷冻离心机中4℃，4000r/min，10min离心，倒掉上清液后，用85%的乙醇洗涤沉淀两次，此沉淀物即为胞外多糖，室温干燥乙醇挥发完全后，加入5ml的PBS后即为胞外多糖抗原，放入-20℃冰箱中保存，备用。

以上所述的抗原免疫培养和分离纯化，主要步骤是：

（1）用PBS将真菌孢子稀释为2*10⁸个/ml，分装后冻存于-20℃冰箱；

（2）第1天，取1ml抗原加入1ml福氏完全佐剂，乳化，将一滴乳化抗原液滴入生理盐水中检验，不散开表明已达到要求；在颈背部皮下多点注射，免疫两只新西兰白兔；

（3）两周后，取1ml抗原加入1ml福氏不完全佐剂，乳化，将一滴乳化抗原液滴入生理盐水中检验，不散开表明已达到要求；在颈背部皮下多点注射，免疫两只新西兰白兔；

（4）每隔2周，按照步骤（3）所述的方法检验；

（5）测定效价合格后，颈动脉取血；

（6）兔血在4℃放置过夜，于4℃，10000rpmr/min冷冻离心机中离心30min，收集上清液。