[发明专利]甘蔗黑穗病病原菌多克隆抗体的制备

权利要求书

1.一种甘蔗黑穗病病原菌多克隆抗体的制备，其特征在于：采集甘蔗大田的甘蔗黑穗病病原菌，制备抗原，将抗原在PDA培养基上培养获得到多克隆抗体，主要包括以下步骤：

（1）抗原采集和制备：在甘蔗大田采集黑穗病病原菌，制备抗原（真菌孢子，菌丝体胞外多糖或上清液）备用；

（2）抗原免疫培养：将获得的抗原与等量的福氏完全佐剂混合，乳化，在颈背部皮下多点注射，免疫新西兰白兔；第15天，取1 ml抗原加入等量福氏不完全佐剂，乳化，在颈背部皮下多点（8-10点）注射，免疫新西兰白兔；每隔2周，按照所述的剂量和方法多次免疫白兔，在第八周测定效价达到要求后，颈动脉取血备用；

（2）分离纯化：将步骤（2）获得的抗血清进行分离纯化，获得目标多克隆抗体。

2.如权利要求1所述的甘蔗黑穗病病原菌多克隆抗体的制备，其特征在于：所述的抗原采集和制备，主要步骤是：

（1）从甘蔗大田中采集黑穗病鞭子，将白色薄膜去除后，将黑穗病真菌孢子粉收集到牛皮纸袋中，然后于45℃中烘干1 h，用保鲜袋包好存于4℃冰箱中备用；

（2）将真菌孢子用无菌水按50-100个孢子/ml稀释，涂布于含有50 ng/ml链霉素的PDA固体培养基上，于28℃恒温培养箱中培养3天，获取单菌落后，挑取少许菌丝体到含有50 ng/ml链霉素的PDA液体培养基中，于28℃恒温培养箱中培养2天；

（3）上清液抗原的制备：量取适量步骤（2）的培养液，于冷冻离心机中4℃，4000 r/min，5 min离心，取上层清液作为抗原，放入-20℃冰箱中保存，备用；

（4）菌丝体胞外多糖抗原的制备：量取适量步骤（2）的培养液，于冷冻离心机中4℃，4000 r/min，5 min离心，吸取上清液，加入2 倍体积的95 %的乙醇，用灭菌的玻璃棒搅起丝状沉淀物，再于冷冻离心机中4℃，4000 r/min，10 min离心，倒掉上清液后，用85%的乙醇洗涤沉淀两次，此沉淀物即为胞外多糖，室温干燥乙醇挥发完全后，加入5 ml的PBS后即为胞外多糖抗原，放入-20℃冰箱中保存，备用。

3.如权利要求1所述的甘蔗黑穗病病原菌多克隆抗体的制备，其特征在于：所述的抗原免疫培养和分离纯化，主要步骤是：

（1）用PBS将真菌孢子稀释为2*10⁸个/ml，分装后冻存于-20℃冰箱；

（2）第1天，取1 ml抗原加入1 ml福氏完全佐剂，乳化，将一滴乳化抗原液滴入生理盐水中检验，不散开表明已达到要求；在颈背部皮下多点（8-10点）注射，免疫两只新西兰白兔；

（3）两周后，取1 ml抗原加入1 ml福氏不完全佐剂，乳化，将一滴乳化抗原液滴入生理盐水中检验，不散开表明已达到要求；在颈背部皮下多点（8-10点）注射，免疫两只新西兰白兔；

（4）每隔2周，按照步骤（3）所述的方法检验；

（5）测定效价合格后，颈动脉取血；

（6）兔血在4℃放置过夜，于4℃，10000 r/min冷冻离心机中离心30 min，收集上清液。