[发明专利]检测肿瘤标志物流动注射化学发光免疫传感器的制备及应用

说明书

技术领域

本发明涉及免疫标记物检测技术领域，更具体的说是一种流动注射化学发光免疫传感器的制备本发明还涉及采用所述的流动注射化学发光传感器测免疫标记物的方法。 

背景技术

近年来，免疫分析是临床检验中一项重要的肿瘤疾病的诊治手段。一直以来，恶性肿瘤也就是癌症都是人类健康和生命安全的一个严重威胁。癌症细胞，是指一些拥有分裂潜能的细胞在致癌因素的作用下发生了恶性转化和克隆性增生而产生的一种新生物。并且癌细胞除了自身的生长失控外，还会侵入周遭正常组织甚至可以经由体内的循环系统或者淋巴系统转移到身体的其他部分，从而引起身体病变甚至死亡。所以，癌症早期的诊断和及早的治疗具有重要的意义。但是癌症早期的抗原含量较低很难被发现，低含量的抗原的测定成为了分析人员的重要追求。 

免疫分析法是利用抗体与抗原特异性结合反应检测各种物质（药物、激素、蛋白质、微生物等）的高选择性生物化学方法。近年来，随着现代生物传感器技术的不断发展，免疫分析在食品安全、临床诊断、微生物检验、药物分析与环境监测等领域得到了广泛的应用。免疫分析包括非标记性免疫分析和标记性免疫分析。非标记免疫包括免疫扩散和免疫电泳，是可溶性的抗原和相对应的抗体在溶液或凝胶中进行接触，从而形成一种不溶性抗原-抗体复合物进行分离的技术。标记性免疫分析技术是采用光电物质、同位素或酶等示踪物质来标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应，通过对免疫复合物中的标记物信号的测定，从而达到对免疫反应进行监测的目的。标记性免疫分析技术放射免疫分析、酶联免疫吸收分析、毛细管电泳化学发光免疫分析、高效液相色谱化学发光免疫分析、微流控芯片化学发光免疫分析、电化学免疫分析、电致发光免疫分析、荧光免疫技术、胶体金免疫技术和铁蛋白免疫技术等。但是这些免疫分析方法一般耗时较长并且拥有繁琐的加样、温育、洗涤等操作过程，而且操作人员和免疫物质的接触较多，可能对操作的人员的身体健康造成危害。而且有些测定速度快、灵敏度高、检测性低的检测手段需要仪器昂贵，不能在发展中国家普及。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供了一种灵敏度高、检测速度快、试剂用量少，检测肿瘤标志物的流动注射化学发光传感器。 

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下措施来实现的：一种检测检测肿瘤标志物的流动注射化学发光传感器的制备方法，其包括以下步骤： 

（1）利用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）制备流动注射化学发光流通池；

（2）按照现有方法制备出碳量子点，碳包覆的四氧化三铁，二氧化硅和空壳金纳米粒子；

（3）将发光碳量子点修饰在碳包覆的四氧化三铁上，然后将一抗修饰在表面；

（4）将空壳金纳米粒子修饰在二氧化硅粒子上，然后将二抗和葡萄糖氧花酶修饰在空壳金粒子上；

（5）将制作好的化学发光传感器结合流动注射化学发光仪对免疫标记物进行检测。

本发明所述发光碳量子点修饰碳包覆四氧化三铁及空壳金包覆二氧化硅的制备包括以下步骤： 

（1）碳包覆四氧化三铁的制备：将四氧化三铁浸入到硝酸溶液中超声10 min，后通过磁铁的作用进行分离，二次水冲洗，然后在5%的葡萄糖溶液中超声10 min，二次水冲洗，最后四氧化三铁的水溶液在高压釜中以180 ℃中反应10 h；

（2）碳量子点的制备：在pH 7.0的磷酸缓冲溶液（PBS）中，以石墨电极为工作电极，银/氯化银电极为参考电极，铂电极为对电极，在-3.0 V~3.0 V电压范围以0.1 V/s的扫速反应24 h，离心分离，二次水冲洗；

（3）将（1）制备的碳包覆四氧化三铁浸入到0.20%邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯（PDDA）中搅拌20 min使其表面带上正电，然后通过磁铁的作用进行分离，二次水冲洗；

（4）将（3）得到的碳包覆四氧化三铁浸入到（2）得到的碳量子点溶液中并搅拌20 min形成一碳量子点层；

（5）重复以上（3）（4）过程可以得到需要的量子点层数；

（6）（5）中制得碳量子点包覆磁性粒子浸入到1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）溶液中20 min，然后通过磁铁的作用进行分离，PBS冲洗后将一抗加入，反应20 min，最后加入牛血清白蛋白（BSA）封闭活性位点，制备好的溶液保存在4 ℃的冰箱中待用；