[发明专利]制备猪链球菌GZ0565株无痕缺失突变株的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及制备猪链球菌GZ0565株无痕缺失突变株的方法。

背景技术

猪链球菌（Streptococcus suis）是一种革兰氏阳性菌，在全世界广泛分布，可以引起猪的急性败血症、脑膜炎、关节炎及急性死亡，也可导致生猪从业人员感染和死亡。国内外对猪链球菌毒力因子及致病机理进行广泛而深入研究。基因缺失是研究基因功能、阐明致病机理的重要手段。目前，现有技术中猪链球菌缺失株留有抗性基因。抗性基因的存在有可能影响缺失株的特性，并有潜在的生物安全隐患。理想的缺失应该是无痕的，最终无抗性基因。它有以下优点：首先，它没有抗性基因的残留；其次, 可在无痕缺失的基础上，构建双缺失，甚至更多缺失；第三，可用无痕缺失技术进行定点突变，这有利于蛋白功能的研究；第四，由于无痕缺失株没有抗性基因，具有成为疫苗株的潜能。传统方法在制备猪链球菌缺失株的过程中，需要构建含有抗性基因（如氯霉素基因）的质粒，通过直接挑选获得双交换的缺失株。这种方法的缺点在于最终的缺失株含有抗性基因（如氯霉素基因），而且直接挑选双交换的缺失株效率很低。

发明内容

为了解决现有技术中基因缺失猪链球菌含有抗性基因及筛选基因缺失猪链球菌工作量过大等问题，本发明提供了一种制备猪链球菌GZ0565株无痕缺失突变株的方法。

本发明的目的采用如下技术方案实现。

制备猪链球菌GZ0565株无痕缺失突变株的方法，包括如下步骤：采用融合PCR方法，得到由待敲除靶基因上下游片段组成的同源重组片段；将同源重组片段插入pSET4S质粒，然后电转化至猪链球菌GZ0565株的感受态细胞进行同源重组，筛选猪链球菌GZ0565株无痕缺失突变株。

所述同源重组包括第一次同源重组和第二次同源重组；所述第一次同源重组的具体方法为：将电转化后的猪链球菌GZ0565株感受态细胞在添加有壮观霉素的THB培养基、37℃条件下培养，进行第一次同源重组，获得第一重组子；所述第二次同源重组的具体方法为：将第一重组子在THB培养基、28℃条件下培养，进行第二次同源重组，获得第二重组子。

所述筛选猪链球菌GZ0565株无痕缺失突变株的方法为：以第二重组子的基因组DNA为模板，能够扩增出同源重组片段的菌株即为猪链球菌GZ0565株无痕缺失突变株。

在37℃条件下，所述第一重组子能够在THB培养基和含有壮观霉素的THB培养基上生长繁殖，所述第二重组子能在THB培养基上生长繁殖、不能在含有壮观霉素的THB培养基上生长繁殖。

待敲除靶基因为LysM基因时，获得同源重组片段的方法为：以猪链球菌GZ0565基因组DNA为模板，用引物LysM-A和LysM-B扩增LysM基因的上游片段，得到扩增片段1；用引物LysM-C和LysM-D扩增LysM基因下游片段，得到扩增片段2；以扩增片段1和扩增片段2为模板，用引物LysM-A和LysM-D，融合扩增同源重组片段；其中

LysM-A的序列为 ：5’- ctgatcGTCGACAAATTAGCTCCGACAGGTGT -3’，

 LysM-B的序列为 ：5’- GCCTTCAACCGTTCTTTTAAAT -3’，

 LysM-C的序列为： 5’-ATTTAAAAGAACGGTTGAAGGCACTTACAAAAATAACCGTTTCA -3’，

 LysM-D的序列为： 5’- gagtcaGAATTCGGCCCAATCTTTACCTTCTATC -3’。

有益效果

本发明提供的制备猪链球菌GZ0565株无痕缺失突变株的方法，通过两次单交换达到双交换目的，所以大大减少了筛选工作量，提高了筛选效率。另外，该方法得到的猪链球菌GZ0565株无痕缺失突变株，敲除了靶基因基因，但是不含有抗性基因，因此具有成为疫苗株的潜能。采用本发明方法，可以在无痕缺失的基础上，构建双缺失，甚至更多缺失或者进行定点突变以研究蛋白功能。

附图说明

图1是本发明的原理图。其中SPC是指壮观霉素抗性基因。

图2融合PCR扩增产物电泳图，其中泳道1为DL5000 marker; 泳道2 为 片断AB; 泳道3 片断CD; 泳道4为同源重组片断AD。

图3 重组质粒LysM-AD-T的鉴定电泳图，其中泳道1 为 DL5000 marker; 泳道2和3 为重组质粒LysM-AD-T扩增产物。