[发明专利]制备猪链球菌GZ0565株无痕缺失突变株的方法

权利要求书

1.制备猪链球菌GZ0565株无痕缺失突变株的方法，其特征在于包括如下步骤：采用融合PCR方法，得到由待敲除靶基因上下游片段组成的同源重组片段；将同源重组片段插入pSET4S质粒，然后电转化至猪链球菌GZ0565株的感受态细胞进行同源重组，筛选猪链球菌GZ0565株无痕缺失突变株。

2.根据权利要求1所述制备猪链球菌GZ0565株无痕缺失突变株的方法，其特征在于：所述同源重组包括第一次同源重组和第二次同源重组；所述第一次同源重组的具体方法为：将电转化后的猪链球菌GZ0565株感受态细胞在添加有壮观霉素的THB培养基、37℃条件下培养，进行第一次同源重组，获得第一重组子；所述第二次同源重组的具体方法为：将第一重组子在THB培养基、28℃条件下培养，进行第二次同源重组，获得第二重组子。

3.根据权利要求2所述制备猪链球菌GZ0565株无痕缺失突变株的方法，其特征在于：所述筛选猪链球菌GZ0565株无痕缺失突变株的方法为：以第二重组子的基因组DNA为模板，能够扩增出同源重组片段的菌株即为猪链球菌GZ0565株无痕缺失突变株。

4.根据权利要求3所述制备猪链球菌GZ0565株无痕缺失突变株的方法，其特征在于：在37℃条件下，所述第一重组子能够在THB培养基和含有壮观霉素的THB培养基上生长繁殖，所述第二重组子能在THB培养基上生长繁殖、不能在含有壮观霉素的THB培养基上生长繁殖。

5.根据权利要求4所述制备猪链球菌GZ0565株无痕缺失突变株的方法，其特征在于：待敲除靶基因为LysM基因时，获得同源重组片段的方法为：以猪链球菌GZ0565基因组DNA为模板，用引物LysM-A和LysM-B扩增LysM基因的上游片段，得到扩增片段1；用引物LysM-C和LysM-D扩增LysM基因下游片段，得到扩增片段2；以扩增片段1和扩增片段2为模板，以LysM-A和LysM-D为引物，采用融合PCR方法扩增同源重组片段；其中

LysM-A的序列为 ：5’- ctgatcGTCGACAAATTAGCTCCGACAGGTGT -3’，

 LysM-B的序列为 ：5’- GCCTTCAACCGTTCTTTTAAAT -3’，

 LysM-C的序列为： 5’-ATTTAAAAGAACGGTTGAAGGCACTTACAAAAATAACCGTTTCA -3’，

 LysM-D的序列为： 5’- gagtcaGAATTCGGCCCAATCTTTACCTTCTATC -3’。