[发明专利]一种纳米介孔材料固定靶蛋白筛选中药活性成分的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种筛选中药活性成分的方法，尤其涉及一种纳米介孔材料固定靶蛋白筛选中药活性成分的方法。

背景技术

药物筛选是现代药物开发过程中测试和获取特定生理活性化合物的一个步骤,是通过规范化的实验手段从大量化合物或者新化合物中选择对某一特定作用靶点具有较高活性的化合物的过程。药物靶点包括基因位点、受体、酶、离子通道、核酸等生物大分子，近年的研究表明，酶作为药物靶点具有很多优势，且已获得了很多重要的研究成果。

但是，传统利用靶蛋白为靶点进行中药筛选，一般都采用将靶蛋白与底物/中药水溶液混合孵育一段时间，利用紫外分光光度计测吸光值，从而进行抑制剂的筛选，这种方法酶容易失活，而且筛选结果可靠度不高，且无法判断抑制类型。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种纳米介孔材料固定靶蛋白筛选中药活性成分的方法，克服现有技术中采用将靶蛋白与底物/中药水溶液混合孵育一段时间，再利用紫外分光光度计测吸光值，进行抑制剂的筛选，这种方法靶蛋白容易失活，且筛选结果可靠度不高，无法判断抑制类型的缺陷。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种纳米介孔材料固定靶蛋白筛选中药活性成分的方法，包括以下步骤：

步骤A：制备固定化靶蛋白：采用物理吸附法，将靶蛋白溶于的最适pH的缓冲液中，加入介孔材料，冰浴条件下搅拌孵育；

步骤B：制备固定化靶蛋白抑制剂筛选模型：以水为流动相，将步骤A所述固定化靶蛋白装入色谱柱中，形成固定化靶蛋白抑制剂模型；

步骤C：验证步骤B制备的固定化靶蛋白抑制剂模型的有效果性；

首先，选择对靶蛋白具有代表性抑制作用的抑制剂；再将步骤B制备的靶蛋白抑制剂模型连接液相色谱仪，将一定量的靶蛋白抑制剂溶于与步骤A中所述缓冲液pH相同的缓冲液中作为第一流动相；

其次，开启液相色谱仪，用所述第一流动相平衡柱子，每隔固定时间进样靶靶蛋白的饱和浓度的底物固定次数，收集不同时刻的出峰第一馏分；进样靶靶蛋白的饱和浓度的底物固定次数后，将所述的第一流动相换成不含固定化靶酶抑制剂的与步骤A中所述缓冲液pH相同的缓冲液，每隔固定时间进样靶蛋白的饱和浓度的底物固定次数，收集不同时刻的出峰第二馏分；

最后，收集的不同时刻出峰第一馏分和不同时刻出峰第二馏分分别冷冻干燥，溶于水，用色谱柱分离底物和产物，纪录不同时刻出峰第一馏分产物及不同时刻出峰第二馏分产物的峰面积。

步骤D：重复步骤A和步骤B的步骤，将步骤B制备的固定化靶酶抑制剂模型连接液相色谱仪，将与步骤A中所述缓冲液pH相同的缓冲液中作为第二流动相；开启液相色谱仪，用所述的第二流动相平衡柱子，固定时间进样靶蛋白的饱和浓度的底物，收集不同时刻出峰第三馏分，将不同时刻的出峰第三馏分冷冻干燥，溶于水，用色谱柱分离底物和产物，纪录的出峰第三馏分产物峰面积；所述出峰第三馏分产物为靶蛋白与底物未受抑制剂影响反应后的产物；

步骤E：固定化靶蛋白抑制剂的抑制曲线：以时间为横坐标，以靶蛋白的残余活力为纵坐标，制作随时间改变，靶蛋白经历活性被抑制和活性恢复的过程曲线；所述残余活力为不同时刻的出峰第一馏分产物峰面积或不同时刻的出峰第二馏分产物峰面积与所述不同时刻的出峰第三馏分产物面积之比；

步骤F：参照上述步骤A至步骤E中的方法，将方法中的固定化靶蛋白抑制剂换成天然药物，筛选天然药物中活性成分，考察其对靶蛋白的抑制作用及抑制类型。

根据试验数据绘制靶蛋白活性被抑制和活性恢复的过程曲线图的可以得知，在该浓度下，抑制剂对靶蛋白的最大抑制率；同时根据最终靶蛋白活性恢复的结果，可以得知该抑制剂是可逆抑制剂还是不可逆抑制剂。

本发明的有益效果是：本发明利用具有无毒无害、孔径可调、柱压低等优势的介孔材料固定化靶蛋白，装入色谱柱，利用对靶蛋白具有代表性抑制作用的靶蛋白抑制剂对模型进行验证后，在利用验证模型的方法将天然产物溶于缓冲液中作为流动相，每隔固定的时间进样饱和浓度的底物，收集出峰馏分，收集出峰馏分固定次数后将流动性换成不含天然产物的缓冲液，每隔固定的时间进样饱和浓度的底物，收集出峰馏分。通过改变流动相使靶蛋白经历抑制和活性恢复的过程。之后将收集的馏分用色谱柱分析，根据产物的峰面积判断中药是否有抑制作用以及抑制的类型。该方法具有可靠性高、在线等优点。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述介孔材料为羧基或氨基修饰的有机介孔氧化硅材料。